Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien
Summary
Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien Ca<sup> 2 +</sup> Handhabung, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Das Verfahren zur Beantragung hochwertige und funktionale Herzmitochondrien wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
Das mitochondriale Permeabilitätsübergang Pore (mtPTP) ein nicht spezifischen Kanal, der in der inneren mitochondrialen Membran bildet für gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht kleiner als 1,5 kDa transportieren. Obwohl die definitive molekulare Identität der Pore wird noch diskutiert, tragen Proteine wie Cyclophilin D, VDAC und ANT zur Bildung mtPTP. Während die Beteiligung von mtPTP Öffnung in Zelltod gut 1 festgelegten vermehrt Hinweise darauf gibt, dass die mtPTP eine physiologische Rolle dient während mitochondriale Ca 2 +-Homöostase 2, Bioenergetik und Redox Signaling 3.
mtPTP Öffnung durch Matrix Ca 2 + ausgelöst aber seine Aktivität kann durch verschiedene andere Faktoren, wie oxidative Stress, Adeninnucleotid Depletion, hohe Konzentrationen von Pi, Mitochondrienmembran Depolarisation oder Entkuppeln und langkettigen Fettsäuren 4 moduliert. In vitro mtPTP Öffnung kann ach seinieved durch Erhöhen Ca 2 +-Konzentration innerhalb der mitochondrialen Matrix durch exogene Zugabe von Ca 2 + (Calcium Retention Capacity). Wenn Ca 2 +-Spiegel in den Mitochondrien zu erreichen eine bestimmte Schwelle, wird das mtPTP und erleichtert Ca 2 +-Freisetzung, die Ableitung des Protons treibende Kraft, Membranpotential Kollaps und eine Erhöhung der mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung), die letztlich zum Bruch der äußeren Membran der Mitochondrien und irreversiblen Verlust der Organellen-Funktion.
Hier beschreiben wir eine fluorimetrischen Assay, die für eine umfassende Charakterisierung der mtPTP Öffnung in isolierten Maus-Mitochondrien ermöglicht. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von 3 mitochondrialen Parameter verändert, wenn mtPTP Öffnung eintritt sind: mitochondrialen Ca 2 +-Handling (Aufnahme und Abgabe, wie durch Ca2 +-Konzentration im Testmedium gemessen), Mitochondrienmembranpotential und mitochondrial Volumen. Die Farbstoffe für Ca 2 +-Messung eingesetzt im Testmedium und Mitochondrienmembranpotential sind Fura FF, einer Membran impermeante, ratiometrisch Indikator, der eine Verschiebung in der Anregungswellenlänge in Gegenwart von Ca 2 + und JC-1, ein kationisches erfährt, ratiometrische Indikator, grün oder rot Monomeren Aggregate bildet bei niedrigen und hohen Membranpotential sind. Veränderungen im mitochondrialen Volumens erfolgt durch Aufnahme Lichtstreuung durch den mitochondrialen Suspension gemessen. Da qualitativ hochwertige, funktionelle Mitochondrien für die mtPTP Öffnung Assay erforderlich sind, beschreiben wir auch die notwendigen Schritte zu erhalten intakt, stark gekoppelte und funktionelle isolierten Herzen Mitochondrien.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt die notwendigen experimentellen Schritte permeability transition pore Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien (Abbildung 1 und Abbildung 4) zu beurteilen: das Verfahren zur Isolierung von Maus-Mitochondrien, die Atemwege Steuerelemente, die ihre Integrität und Funktionalität zu gewährleisten, die mitochondriale Parameter während überwacht mtPTP Öffnung und die Farbstoffe für ihre Messung eingesetzt, die Einrichtung des spektrofluoro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von HL094536 (BJH) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
