Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии
Summary
Spectrofluorometric протокол для измерения проницаемости митохондриальной переход пор отверстие в изолированном сердце мыши митохондрий, представленные здесь. Анализ включает в себя одновременное измерение митохондрий Ca<sup> 2 +</sup> Обработка, мембраны митохондрий и митохондриальной потенциальных объемов. Процедура получения качественных и функциональных митохондрий сердца также описан.
Abstract
Митохондриальной поры перехода проницаемости (mtPTP) является не определенный канал, который образует на внутренней митохондриальной мембраны для транспортировки растворенных веществ с молекулярной массой менее 1,5 кДа. Хотя окончательное молекулярно личности пор находится в стадии обсуждения, белки, такие как циклофилин D, VDAC и ANT вклад в формирование mtPTP. Хотя участие в открытии mtPTP гибели клеток хорошо известно 1, накапливаются данные свидетельствуют о том, что mtPTP служит физиологическая роль в митохондриальной Ca 2 + гомеостаза 2, биоэнергетика и окислительно-восстановительные сигнализации 3.
mtPTP открытие вызвано матрицы Ca 2 +, но его активность может быть модулированным ряда других факторов, таких как окислительный стресс, аденин нуклеотидных истощение, высокая концентрация Pi, митохондриальной деполяризации мембраны или разобщение, и длинные цепочки жирных кислот 4. в пробирке, mtPTP Открытие может быть ACHieved за счет увеличения концентрации Са 2 + в митохондриях путем добавления экзогенного Ca 2 + (мощность удержания кальция). Когда Ca 2 + уровней внутри митохондрий достигает определенного порога, mtPTP открывает и облегчает Са 2 +, диссипация движущей силой протонов, мембранный потенциал коллапса и увеличение объема митохондриальной матрицы (отек), что в конечном итоге приводит к разрыву внешней митохондриальной мембраны и необратимой потере функции органелл.
Здесь мы опишем флуорометрической анализа, который позволяет всеобъемлющей характеристикой mtPTP открытия в изолированном сердце мыши митохондрий. Анализ включает в себя одновременное измерение от 3 митохондриальных параметров, которые изменяются при открытии mtPTP происходит: митохондриальная Ca 2 + обработка (поглощение и освобождение, измеряемые концентрации Са 2 + в тесте среды), митохондриальный мембранный потенциал, и mitochondrial объеме. Красители, используемые для Ca 2 + измерение в среде анализа и митохондриального мембранного потенциала являются Fura FF, мембранные impermeant, логометрические индикатор, который претерпевает сдвиг длины волны возбуждения в присутствии Ca 2 + и JC-1, катионные, логометрические индикатор, который образует зеленую или красную мономеров агрегатов при низких и высоких мембранного потенциала, соответственно. Изменения в митохондриальной объем измеряется путем регистрации рассеяния света митохондриальной суспензии. С высоким качеством, функциональными митохондрий, необходимых для анализа открытии mtPTP, мы также описываются шаги, необходимые для получения нетронутыми, очень связаны и функциональные изолированного сердца митохондрий.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь описываются необходимые экспериментальные шаги для оценки проницаемости переход пор открытие в изолированных митохондриях сердца (рис. 1 и 4): процедура выделения мышью митохондрий сердца, дыхательной управления, обеспечения их целост…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
