Multi-paramètres de mesure de l'ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées
Summary
Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries Ca<sup> 2 +</sup> Manipulation, le volume potentiel de la membrane mitochondriale et mitochondrial. La procédure pour l'obtention de coeur et de grande qualité fonctionnelle des mitochondries est également décrit.
Abstract
Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mtPTP) est un canal non spécifique qui se forme dans la membrane mitochondriale interne pour transporter les solutés de masse moléculaire inférieure à 1,5 kDa. Bien que l'identité définitive moléculaire du pore est encore en débat, des protéines telles que la cyclophiline D, VDAC et ANT contribuer à mtPTP formation. Alors que la participation de l'ouverture mtPTP dans la mort cellulaire est bien établi 1, l'accumulation de preuves indique que le mtPTP joue un rôle physiologique pendant mitochondrial homéostasie du Ca 2 + 2, la bioénergétique et de signalisation redox 3.
mtPTP ouverture est déclenchée par la matrice Ca 2 +, mais son activité peut être modulée par de nombreux autres facteurs tels que le stress oxydatif, l'adénine nucléotide épuisement, de fortes concentrations de Pi, dépolarisation de la membrane mitochondriale ou de désaccouplement, et les acides gras à longue chaîne 4. In vitro, mtPTP l'ouverture peut être achieved en augmentant la concentration de Ca + 2 à l'intérieur de la matrice mitochondriale par des ajouts exogènes de Ca 2 + (capacité de rétention de calcium). Lorsque les niveaux de Ca 2 + à l'intérieur des mitochondries atteindre un certain seuil, la mtPTP ouvre et facilite libération de Ca 2 +, la dissipation de la force proton motrice, l'effondrement du potentiel de membrane et une augmentation de volume de la matrice mitochondriale (gonflement) qui conduit finalement à la rupture de la la membrane externe mitochondriale et la perte irréversible de la fonction des organites.
Nous décrivons ici un essai fluorimétrique qui permet une caractérisation complète de l'ouverture mtPTP dans le cœur de souris mitochondries isolées. Le test consiste à mesurer simultanément les 3 paramètres mitochondriaux qui sont modifiés lors de l'ouverture se produit mtPTP: mitochondrial Ca 2 + (absorption et de libération, telle que mesurée par la concentration de Ca 2 + dans le milieu d'essai), le potentiel de membrane mitochondriale, et mitochole volume ndrial. Les colorants utilisés pour la mesure de Ca 2 + dans le milieu d'essai et le potentiel de membrane mitochondrial sont Fura FF, une membrane imperméant, indicateur logométrique qui subit un changement de la longueur d'onde d'excitation en présence de Ca 2 +, et JC-1, cationique, Indicateur ratiométrique qui forme monomères verts ou rouges agrégats au potentiel de membrane haute et basse, respectivement. Les variations de volume mitochondrial sont mesurées par diffusion de la lumière par l'enregistrement de la suspension mitochondriale. Depuis de haute qualité, les mitochondries fonctionnelles sont nécessaires pour l'essai d'ouverture mtPTP, nous décrivons également les mesures nécessaires pour obtenir intacte, le cœur fortement couplé et fonctionnelles des mitochondries isolées.
Protocol
Discussion
Le protocole présenté ici décrit les étapes nécessaires expérimentales pour évaluer ouverture de pore de transition de perméabilité dans le cœur des mitochondries isolées (Figure 1 et Figure 4): la procédure d'isolement de cœur de souris mitochondries, les contrôles des voies respiratoires en assurer l'intégrité et la fonctionnalité, les paramètres mitochondriaux surveillés pendant ouverture mtPTP et les colorants utilisés pour leur évaluation, la mise en pl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
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