מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה
Summary
פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca מיטוכונדריה<sup> 2 +</sup> טיפול, קרום נפח פוטנציאלי ומיטוכונדריה המיטוכונדריה. ההליך לקבלת לב איכותי ופונקציונלי המיטוכונדריה הוא גם תאר.
Abstract
נקבובי מעבר חדירות המיטוכונדריה (mtPTP) הוא ערוץ מסוים שאינם נוצר בקרום המיטוכונדריה הפנימי להובלה מומסת עם מסה מולקולרית קטנה מ -1.5 kDa. למרות הזהות המוחלטת המולקולרית של נקבובי היא עדיין תחת דיון, חלבונים כגון cyclophilin D, VDAC וANT לתרום להיווצרות mtPTP. למרות המעורבות של פתיחת mtPTP במוות של תאים מבוססת היטב 1, מצטבר ראיות מצביע על כך שmtPTP משרת תפקיד פיסיולוגי במהלך המיטוכונדריה Ca 2 + הומאוסטזיס 2, bioenergetics וחמזור איתות 3.
פתיחת mtPTP מופעלת על ידי מטריקס Ca 2 + אבל פעילותו יכולה להיות מווסתת על ידי מספר גורמים אחרים כגון סטרס חמצונים, דלדול נוקלאוטיד אדנין, ריכוזים גבוהים של פי, שלילת קוטביות הקרום המיטוכונדריה או תרה, וחומצות שומן ארוכת שרשרת 4. במבחנה, mtPTP פתיחה יכולה להיות achieved על ידי הגדלת ריכוז + Ca 2 בתוך מטריצת המיטוכונדריה באמצעות תוספת חיצונית של Ca 2 + (קיבולת אצירת סידן). כאשר Ca 2 + רמות בתוך המיטוכונדריה מגיע לסף מסוים, ומאפשר mtPTP פותח Ca 2 + שחרור, פיזורו של כוח מניע הפרוטונים, קריסת פוטנציאל קרום וגידול בהיקף מטריקס המיטוכונדריה (נפיחות) שסופו של דבר מוביל לקרע של קרום חיצוני של המיטוכונדריה ואובדן בלתי הפיך של תפקוד אברון.
כאן אנו מתארים assay fluorometric המאפשר אפיון מקיף של פתיחת mtPTP בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של 3 פרמטרי המיטוכונדריה ששינו כאשר פתיחת mtPTP מתרחשת: המיטוכונדריה Ca 2 + הטיפול (ספיגה ושחרורו, כפי שהיא נמדדת על ידי Ca 2 + ריכוז במדיום assay) פוטנציאלית, מיטוכונדריה ממברנה, וmitochoנפח ndrial. את הצבעים המועסקים על Ca 2 + מדידה במדיום assay ופוטנציאל הקרום המיטוכונדריה הם Fura FF, impermeant קרום, מחוון ratiometric שעובר שינוי באורך גל העירור בנוכחות Ca 2 +, וJC-1, קטיוני, מחוון ratiometric המהווה מונומרים ירוקים או אדומים אגרגטים בפוטנציאל קרום נמוך וגבוה, בהתאמה. שינויים בהיקף המיטוכונדריה נמדדים על ידי הקלטת פיזור אור על ידי ההשעיה של המיטוכונדריה. מאז באיכות גבוהה, המיטוכונדריה פונקציונלית נדרשות לבדיקת פתיחת mtPTP, אנחנו גם מתארים את הצעדים הדרושים כדי להשיג לב שלם, בשילוב ומאוד פונקציונלי מבודד המיטוכונדריה.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הצעדים הניסיוניים הדרושים כדי להעריך פתיחה נקבובית מעבר חדירות בלב מיטוכונדריה מבודד (איור 1 ואיור 4): ההליך לבידוד לב העכבר מיטוכונדריה, פקדי נשימה המבטיחים יושרה והפונקציונלית שלהם, פרמטרים המיטוכונדרי במעקב במהלך פתיחת mtPTP ואת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
