Multi-parameter Måling af permeabilitetsovergang pore åbning i isolerede Mouse Heart Mitokondrier
Summary
Et spektrofluorometrisk protokol for målingen af mitokondriel permeabilitetsovergang pore åbning i isoleret muse hjerte mitokondrier er præsenteret her. Assayet involverer samtidig måling af mitokondrier Ca<sup> 2 +</sup> Håndtering, mitokondriemembranspændingen og mitokondrie volumen. Proceduren for at indhente høj kvalitet og funktionelle hjerte mitokondrier er også beskrevet.
Abstract
Den mitokondriel permeabilitetsovergang pore (mtPTP) er en ikke specifik kanal, der dannes i den indre mitokondriemembran at transportere opløste stoffer med en molekylvægt mindre end 1,5 kDa. Selv om den endelige molekylære identitet af pore er stadig under debat, proteiner, såsom cyclophilin D, VDAC og ANT bidrage til mtPTP formation. Mens inddragelsen af mtPTP åbning i celledød er veletableret 1, akkumulere beviser tyder på, at mtPTP serverer en fysiologisk rolle under mitochondrial Ca 2 + homeostase 2, bioenergetik og redox signalering 3.
mtPTP åbning udløses af matrix Ca2 +, men dets aktivitet kan moduleres ved en række andre faktorer, såsom oxidativt stress, adeninnukleotid udtømning, høje koncentrationer af Pi, mitokondriel membrandepolarisering eller frakobling, og langkædede fedtsyrer 4. in vitro mtPTP åbningen kan være achieved ved at forøge Ca2 +-koncentration inden for mitochondrial matrix via exogene tilsætninger af Ca2 + (calcium tilbageholdelseskapacitet). Når Ca2 + niveauer inde mitokondrier når en bestemt tærskel, mtPTP åbnes og fremmer Ca2 +-frigivelse, dissipation af proton motorkraft, membranpotentiale kollaps og en stigning i mitochondrial matrix volumen (hævelse), som i sidste ende fører til brud på ydre mitochondriemembran og uopretteligt tab af organel funktion.
Her beskriver vi et fluorometrisk assay, som tillader en omfattende karakterisering af mtPTP åbning i isolerede mus hjerte mitokondrier. Assayet involverer samtidig måling af 3 mitokondrielle parametre, der ændres, når mtPTP åbning opstår: mitochondrial Ca2 + håndtering (optagelse og frigivelse som målt ved Ca2 +-koncentration i assaymediet), mitokondriemembranspændingen, og mitochondrial volumen. Farvestofferne anvendes til Ca2 +-målingen i assaymediet og mitokondriemembranspændingen er Fura FF, en membran impermeabel, ratiometrisk indikator, der undergår en ændring i excitations-bølgelængden i nærvær af Ca2 +, og JC-1, et kationisk, ratiometrisk indikator, som danner grønne monomerer eller røde aggregater med lav og høj membranpotentiale hhv. Ændringer i mitochondrie volumen måles ved en registrering lysspredning af mitochondrial suspension. Da høj kvalitet, funktionelle mitokondrier er nødvendige for mtPTP åbning assay, vi beskriver også de trin, der er nødvendige for at opnå intakt, stærkt koblet og funktionelle isolerede hjerte mitokondrier.
Protocol
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver de nødvendige eksperimentelle procedure for at vurdere permeabilitetsovergang pore åbning i isolerede hjerte mitokondrier (figur 1 og figur 4): fremgangsmåden til isolering af muse-hjerte mitokondrier, de respiratoriske kontrol, der sikrer deres integritet og funktionalitet, de mitochondriale parametre overvåges under mtPTP åbning og farvestofferne anvendt for deres måling, oprettelsen af den spektrofluorometrisk instrumentering og kara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
