Fabrication et utilisation de puces à micro-environnement (MEArrays)
Summary
Un procédé de criblage combinatoire fonctionnelle pour obtenir un aperçu des effets de la composition moléculaire du microenvironnement sur les fonctions cellulaires est décrite. La méthode tire parti des microréseaux à base de technologies permettant de créer des tableaux de définis microenvironnements combinatoires qui soutiennent l'adhésion cellulaire et l'analyse fonctionnelle.
Abstract
Les interactions entre les cellules et leur microenvironnement environnante avoir des conséquences fonctionnelles de comportement cellulaire. Le niveau de la cellule unique, microenvironnements distincts peuvent imposer la différenciation, la migration et la prolifération des phénotypes, et sur le niveau des tissus du microenvironnement processus aussi complexe que la morphogenèse et la tumorigenèse 1. Non seulement la cellule et son contenu moléculaire de l'impact des micro-environnements les cellules à l'intérieur, mais il ne faut l'élasticité 2 et 3 de la géométrie des tissus. Définie comme la somme de cellule à cellule, ECM-, et solubles dans les interactions de facteurs, en plus des caractéristiques physiques, le micro-environnement est complexe. Les phénotypes de cellules dans un tissu sont partiellement en raison de leur teneur en génomique et en partie en raison des interactions combinatoires avec le microenviroment. Un défi majeur est de relier des combinaisons spécifiques de composants micro-environnement des comportements distinctifs.
ent "> Ici, nous présentons le micro-puces à ADN (MEArray) plate-forme de criblage cellulaire fonctionnelle des interactions avec les micro-environnements combinatoires 4. La méthode permet le contrôle simultané de la composition moléculaire et le module d'élasticité, et combine l'utilisation de puces à ADN largement disponibles technologies micromodelage et. écrans MEArray nécessitent aussi peu que 10.000 cellules par réseau, ce qui facilite les études fonctionnelles des types de cellules rares, telles que les cellules souches adultes. Une limitation de cette technologie est que microenvironnements tissulaires entières peuvent pas être complètement récapitulé sur MEArrays. Cependant, la comparaison des réponses dans le même type de cellule à de nombreux micro-environnements connexes, par exemple les combinaisons deux à deux des protéines de la MEC qui caractérisent un tissu donné, donnera un aperçu de la manière dont les composants du microenvironnement obtenir des phénotypes spécifiques de tissus fonctionnels.MEArrays peuvent être imprimés en utilisant une grande variété de recombinaison growth facteurs, des cytokines, des protéines purifiées et ECM, et des combinaisons de ceux-ci. La plate-forme est uniquement limitée par la disponibilité des réactifs spécifiques. MEArrays se prêtent à temps caduc analyse, mais sont le plus souvent utilisées pour les analyses de point final de fonctions cellulaires qui sont mesurables avec des sondes fluorescentes. Par exemple, la synthèse de l'ADN, l'apoptose, l'acquisition d'états différenciés, ou la production de produits de gènes spécifiques sont habituellement mesurés. En bref, le débit de base d'une expérience MEArray est de préparer des lames recouvertes de substrats d'impression et de préparer la plaque de maître de protéines qui doivent être imprimés. Puis les tableaux sont imprimés avec un robot de puces à ADN, des cellules sont autorisés à fixer, croître en culture, puis sont fixés chimiquement après avoir atteint le point limite expérimental. Dosages fluorescents ou colorimétriques, imagées avec des microscopes traditionnels ou les scanners puces à ADN, sont utilisés pour révéler pertinentes phénotypes moléculaires et cellulaires (figure 1).
Protocol
Discussion
La méthode présentée ici permet MEArray analyses fonctionnelles des cellules et les interactions combinatoires microenvironnement 4. MEArray analyse combine l'utilisation des technologies de base micromodelage, biologie cellulaire, et des robots d'impression microarray et des dispositifs d'analyse qui sont disponibles dans les installations multi-utilisateurs nombreux. MEArray écrans sont compatibles avec la plupart des types de cellules adhérentes, mais sans sérum formulations de milieux pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML est pris en charge par la NIA (R00AG033176 et R01AG040081) et Laboratoire de recherche et de développement en scène, US Department of Energy contrat # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
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