ייצור ושימוש של microarrays Microenvironment (MEArrays)
Summary
שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.
Abstract
יחסי הגומלין בין התאים וסביבתם Microenvironment יש השלכות תפקודיות להתנהגות סלולרית. ברמת התא הבודדה, microenvironments שונה יכול לכפות בידול, הגירה, ופנוטיפים תפוצה, וגם ברמת רקמות microenvironment תהליכים מורכב כמו המורפוגנזה וtumorigenesis 1. לא רק שתא ותכולה מולקולרית של השפעת microenvironments את התאים מבפנים, אבל כך גם הגמישות 2 ו 3 גיאומטריה של הרקמה. מוגדר כסכום הכולל של תאי תאים,-ECM, ומסיסות אינטראקציות של גורמים, בנוסף למאפיינים פיסיים, microenvironment הוא מורכב. פנוטיפים של תאים בתוך רקמה באופן חלקי בשל התכולה הגנומי שלהם וחלקו בשל האינטראקציות קומבינטורית עם microenviroment. אתגר גדול הוא לקשר שילובים ספציפיים של רכיבי microenvironmental עם התנהגויות ייחודיות.
אף אוזן גרון "> כאן, אנו מציגים את פלטפורמת המיקרו microarray (MEArray) להקרנה פונקציונלית מבוססת תאים של אינטראקציות עם microenvironments קומבינטורית 4. השיטה מאפשרת שליטה בו זמנית של ההרכב המולקולרי ומודולוס האלסטיות, ומשלבת את השימוש של microarray הזמין באופן נרחב וטכנולוגיות micropatterning. מסכי MEArray דורשים מעטים כמו 10,000 תאים לכל מערך, המאפשרים לימודים תפקודיים של תאים מסוגים נדירים כגון תאי אב מבוגרים. מגבלה של הטכנולוגיה היא שmicroenvironments רקמות שלמים לא ניתן סכם לחלוטין על MEArrays. עם זאת, השוואה של תגובות באותו סוג תא לmicroenvironments נלווה רב, למשל שילובי pairwise של חלבוני ECM המאפיינים את הרקמה נתונה, תספקנה תובנה כיצד רכיבי microenvironmental לעורר פנוטיפים תפקודיים רקמות ספציפיות.MEArrays ניתן להדפיס תוך שימוש במגוון רחב של רקומביננטי groגורמי wth, הציטוקינים וחלבונים מטוהרים ECM, והצירוף. הפלטפורמה היא מוגבלת רק על ידי הזמינות של חומרים כימיים ספציפי. MEArrays ניתן לניתוח נושן, אבל לרוב משמש לניתוחי נקודת סיום של פונקציות תאיות הניתנות למדידה בבדיקות ניאון. לדוגמה, סינתזת דנ"א, אפופטוזיס, רכישה של מדינות מובחנות, או ייצור של מוצרי גן ספציפיים נמדדת בדרך כלל. בקצרה, את הזרימה הבסיסית של ניסוי MEArray היא להכין שקופיות מצופות מצע הדפסה ולהכין את צלחת ההורים של חלבונים, כי הם להיות מודפסים. אז המערכים מודפסים עם רובוט microarray, תאים מותר לצרף, לגדול בתרבות, ולאחר מכן כימי קבועים עם הגיע לנקודת סיום הניסוי. מבחני פלורסנט או colorimetric, הדמיה עם מיקרוסקופים מסורתיים או סורקי microarray, משמשים כדי לחשוף פנוטיפים מולקולריים ותאיים הנוגעים בדבר (איור 1).
Protocol
Discussion
שיטת MEArray מוצגת כאן מאפשרת ניתוח פונקציונלי של תאים ואינטראקציות Microenvironment קומבינטורית 4. ניתוח MEArray משלב שימוש בטכנולוגיות בסיסיות micropatterning, ביולוגיה של תא, ורובוטי הדפסה microarray ומכשירי ניתוח הזמינים במתקנים מרובים משתמשים רבים. מסכי MEArray תואמים סוגי תאים חסידי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML נתמך על ידי NIA (R00AG033176 וR01AG040081) ועל ידי מעבדת מחקר ופיתוח בימוי, ארה"ב מחלקת אנרגית החוזה # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
