Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)
Summary
Um método de triagem combinatória funcional para obtenção de conhecimentos sobre os impactos da composição molecular de microambientes sobre as funções celulares é descrito. O método tira partido de microarray existentes baseados em tecnologias para gerar matrizes de microambientes definidos combinatórias que suportam a adesão de células e análise funcional.
Abstract
As interações entre as células e seu microambiente circundante tem consequências funcionais para o comportamento celular. No nível de célula única, microambientes distintos podem impor diferenciação, migração, proliferação e fenótipos, e sobre o nível do tecido processa o microambiente complexo como a morfogénese e tumorigénese 1. Não só o celular e molecular conteúdo de microambientes impacto que as células dentro, mas assim como a elasticidade 2 e 3 geometria do tecido. Definido como a soma total de célula-célula,-ECM, e solúveis em interacções dos factores, para além das características físicas, o microambiente é complexa. Os fenótipos de células dentro de um tecido são parcialmente devido ao seu conteúdo genómico e em parte devido às interacções com o microbiota combinatórias. Um grande desafio é unir combinações específicas de componentes microambientais com comportamentos distintos.
ent "> Aqui, nós apresentamos o microambiente microarray plataforma (MEArray) para a célula baseada em triagem funcional de interacções com microambientes combinatórias 4. O método permite um controlo simultâneo da composição molecular e o módulo de elasticidade, e combina a utilização de microarray amplamente disponíveis tecnologias e micropatterning. telas MEArray requerem tão pouco quanto 10.000 células por matriz, o que facilita estudos funcionais de tipos de células raras, tais como as células progenitoras adultas. Uma limitação da tecnologia é que microambientes tecidos inteiros não pode ser completamente recapitulado em MEArrays. No entanto, a comparação das respostas no mesmo tipo de célula a numerosas microambientes relacionados, por exemplo, combinações de pares de proteínas de ECM que caracterizam um dado tecido, irá fornecer informações sobre a forma como os componentes do microambiente eliciar tecido-específicos fenótipos funcionais.MEArrays podem ser impressos usando uma grande variedade de recombinante grofactores wth, citoquinas, e proteínas purificadas de ECM, e suas combinações. A plataforma é limitado apenas pela disponibilidade de reagentes específicos. MEArrays são passíveis de tempo caduco análise, mas na maioria das vezes são usados para análises de ponto final de funções celulares que são mensuráveis com sondas fluorescentes. Por exemplo, a síntese do DNA, a apoptose, a aquisição de estados diferenciados, ou a produção de produtos de genes específicos são normalmente medidos. Resumidamente, o fluxo de base de um experimento MEArray é preparar as lâminas revestidas com substratos de impressão e para preparar a placa mestre de proteínas que estão a ser impressa. Em seguida, as matrizes são impressas com um robô microarray, as células são deixadas a ligar, crescer em cultura, e, em seguida, são quimicamente fixados ao atingir o ponto de extremidade experimental. Ensaios fluorescentes ou colorimétricas, fotografados com microscópios tradicionais ou scanners microarray, são utilizados para revelar relevantes fenótipos celulares e moleculares (Figura 1).
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado permite MEArray análises funcionais da célula e interacções microambiente combinatórias 4. Análise MEArray combina o uso de tecnologias micropatterning básicos, biologia celular, e robôs de microarranjos de impressão e dispositivos de análise que estão disponíveis em instalações multiusuários muitos. MEArray telas são compatíveis com tipos de células mais aderentes, embora formulações meios isentos de soro podem necessitar de ser ajustado em alguns casos, de modo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML é apoiado pela NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e pelo Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Dirigido, EUA Departamento de contrato de Energia # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
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