제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)
Summary
세포 기능에 microenvironments의 분자 구성의 영향에 통찰력을 얻기위한 조합 기능 검사 방법을 설명합니다. 방법은 세포 접착 및 기능 분석을 지원하는 정의 조합 microenvironments의 배열을 생성하기 위해 기존의 microarray 기반 기술을 활용합니다.
Abstract
세포와 주변 microenvironment 사이의 상호 작용은 세포의 행동에 기능 결과가 있습니다. 단일 세포 수준에서 독특한 microenvironments는 차별화, 마이그레이션 및 확산 phenotypes을 부과 할 수 있으며, 조직 수준에서 microenvironment는 morphogenesis와 tumorigenesis 일처럼 복잡한 처리합니다. 만 내 microenvironments 영향 세포의 세포와 분자 내용을했지만 때문에 탄성 2, 조직의 구조 3 할 수 없습니다. 셀 – 셀, – ECM, 및 가용성 요소 상호 작용의 합으로 정의, 물리적 특성뿐 아니라, microenvironment가 복잡합니다. 조직 내에서 세포의 phenotypes는 게놈 콘텐츠 및 microenviroment과 조합 상호 작용에 부분적으로 인해 부분적으로 인해 수 있습니다. 주요 과제는 독특한 행동과 microenvironmental 구성 요소의 특정 조합을 연결하는 것입니다.
다닐 "> 여기에서, 우리는 조합 microenvironments 4 상호 작용의 셀 기반의 기능 검사에 대한 microenvironment microarray (MEArray) 플랫폼을 제시한다. 방법은 분자의 조성과 탄성 계수의 동시 제어 할 수 있으며, 널리 사용 가능한 microarray의 사용을 결합 그리고 micropatterning 기술. MEArray 화면 그러한 성인 전구 세포와 같은 희귀 한 세포 유형의 기능 연구를 용이하게 배열 10,000 세포처럼 몇이 필요합니다. 기술의 한계는 전체 조직 microenvironments이 완전히 MEArrays에 recapitulated 할 수 있습니다.의 그러나, 비교 수많은 관련 microenvironments에 동일한 셀 유형의 응답 예를 들어 특정 조직을 특징 ECM 단백질의 pairwise 조합, microenvironmental 구성 요소가 조직 별 기능 phenotypes을 이끌어내는 방법에 통찰력을 제공 할 것입니다.MEArrays는 재조합 촉진제 다양한을 사용하여 인쇄 할 수 있습니다wth 요인 크린 시토 킨 및 정화 ECM 단백질, 그리고 그 조합. 플랫폼은 특정 시약의 가용성에 의해 제한됩니다. MEArrays 시간은 실효 분석 의무가 있지만, 대부분 형광 프로브와 measureable 아르 세포 기능의 엔드 포인트 분석에 사용됩니다. 예를 들어, DNA 합성, apoptosis, 차별화 된 국가의 수집, 또는 특정 유전자 제품의 생산은 일반적으로 측정합니다. 간단히, MEArray 실험의 기본 흐름이 인쇄 substrata으로 코팅 슬라이드를 준비하고 인쇄 할 아르 단백질의 마스터 판을 준비하는 것입니다. 그런 다음 배열은 microarray 로봇과 함께 인쇄되어, 세포는 첨부 문화에 성장하고 화학적 실험 엔드 포인트에 도달시 고정 할 수 있습니다. 기존의 현미경이나 microarray 스캐너와 이미징 형광 또는 colorimetric assays은, 관련 분자 및 세포 phenotypes (그림 1)을 공개하는 데 사용됩니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시된 MEArray 방법은 셀 및 조합 microenvironment의 상호 작용 4 기능 분석을 할 수 있습니다. MEArray 분석은 기본 micropatterning 기술, 세포 생물학, 및 microarray 인쇄 로봇과 많은 다중 시설에서 사용할 수있는 분석 기기의 사용이 조화를 이루고 있습니다. 혈청이없는 미디어 공법은 첨부 파일을 향상시킬 수 BSA 또는 <1 %의 혈청을 포함하는 경우에 조정해야 할 수도 있지만 MEArray 화면은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 실험실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국과로 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
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