Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)
Summary
Hücresel fonksiyonları üzerinde mikro moleküler bileşim etkileri ilgili bilgi sağlamak için bir kombinatoryal fonksiyonel tarama yöntemi tarif edilmektedir. Yöntemi hücre yapışması ve fonksiyonel analiz destekleyen tanımlı Kombinatoryal mikroçevrelerde diziler oluşturmak için varolan mikroarray tabanlı teknolojileri yararlanır.
Abstract
Hücreler ve onların etrafındaki mikroçevrede arasındaki etkileşimler hücresel davranışı için fonksiyonel sonuçları vardır. Tek hücre düzeyinde, farklı mikroçevrelerde farklılaşma, göç ve proliferasyon fenotipleri empoze edebilir ve doku düzeyinde mikroçevrede morfolojilerinden tümörogenez 1 gibi karmaşık işler. Ancak içinde mikro etki hücrelerin hücre ve moleküler içeriği, ama böylece esneklik 2 ve doku geometrisi 3 kalmaz. Hücre-hücre,-ECM ve-çözünür faktör etkileşimlerinin toplamı olarak tanımlanan, fiziksel özelliklere ek olarak, mikro çevre karmaşıktır. Bir doku içindeki hücrelerin fenotiplerini onların genomik içeriği ve microenviroment ile kombinatoryal etkileşimleri kısmen, kısmen bağlıdır. Büyük bir meydan okuma farklı davranışları ile microenvironmental bileşenleri belirli kombinasyonları bağlamaktır.
ent "> Burada, kombinatoryal mikroçevrelerde 4 etkileşimlerinin hücre tabanlı fonksiyonel tarama mikroçevrede mikroarray (MEArray) platformu sunmak. metodu moleküler yapısı ve elastik modülü eşzamanlı kontrolü sağlar ve yaygın olarak mevcut mikroarray kullanımı birleştiriyor ve micropatterning teknolojileri. MEArray ekranlarında yetişkin progenitör hücreler gibi nadir hücre tiplerinin fonksiyonel çalışmalar kolaylaştırır dizi başına 10.000 hücre kadar az ihtiyaç duyar. teknolojinin bir sınırlama olduğunu tüm doku mikroçevrelerde tamamen MEArrays üzerine değinmeyecek edilemez. Ancak, karşılaştırma çok sayıda ilgili mikro için aynı hücre tipi tepkiler, örneğin, belirli bir doku karakterize ECM proteinlerinin ikili kombinasyonlar, microenvironmental bileşenler doku-spesifik fonksiyonel fenotipleri temin nasıl anlaşılmasını sağlayacaktır.MEArrays rekombinant Gro geniş bir yelpazede kullanarak basılabilirwth faktörleri, sitokinler, ve saflaştırılmış ECM proteinleri ve bunların bileşimleri. Bu platform, sadece belirli reaktiflerin bulunması ile sınırlıdır. MEArrays zaman lapsed analizi mükellef bulunmaktadır, ancak en sık floresan problar ile ölçülebilen hücresel fonksiyonları bitiş noktası analizleri için kullanılır. Örneğin, DNA sentezi, apoptoz, farklılaştırılmış devletlerin edinimi, ya da belirli gen ürünlerinin üretiminde yaygın olarak ölçülür. Kısaca, deney MEArray temel akış baskı alt katman ile kaplanmış slaytlara hazırlamak için ve basılacak olan proteinlerin ana plaka hazırlamaktır. Sonra diziler bir mikroarray robot ile basılır, hücreler, iliştirin kültüründe yetişen ve daha sonra kimyasal deney bitiş noktası ulaştığınızda giderilen izin verilir. Geleneksel mikroskoplar veya mikroarray tarayıcılar ile görüntülenebilir Floresan veya kolorimetrik deneyleri, ilgili moleküler ve hücre fenotipleri (Şekil 1) ortaya çıkarmak için kullanılır.
Protocol
Discussion
Burada sunulan MEArray yöntemi hücre ve kombinatoryal mikroçevresindeki etkileşimleri 4 fonksiyonel analiz sağlar. MEArray analizi temel micropatterning teknolojileri, hücre biyolojisi ve mikroarray baskı robotlar ve birçok çok kullanıcılı tesisleri mevcuttur analiz cihazları kullanımı birleştiriyor. Serumsuz ortam formülasyonlar ek artırmak BSA ya da <% 1 serum dahil etmek için bazı durumlarda ayarlanması gerekebilir rağmen MEArray ekranlar, en yapışık hücre tipleri ile uyumludur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML NIA (R00AG033176 ve R01AG040081) tarafından ve Laboratuvar Yönetmen Araştırma ve Geliştirme, # DE-AC02-05CH11231 Enerji sözleşme ABD tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
