Fabrikasjon og bruk av mikromiljøet microarrays (MEArrays)
Summary
En kombinatoriske funksjonell screening metode for å få innsikt i konsekvensene av den molekylære sammensetningen av microenvironments på cellulære funksjoner er beskrevet. Metoden utnytter eksisterende microarray-baserte teknologier for å generere matriser med definerte kombinatoriske microenvironments som støtter celleadhesjon og funksjonell analyse.
Abstract
Samspillet mellom cellene og deres omkringliggende mikromiljøet har funksjonelle konsekvenser for mobilnettet atferd. På enkelt celle nivå, kan distinkte microenvironments pålegge differensiering, migrering og spredning fenotyper, og på vev nivå mikromiljøet behandler like kompleks som morphogenesis og tumorigenesis en. Ikke bare gjør cellen og molekylære innhold microenvironments tyngre cellene innenfor, men det gjør elastisiteten 2 og geometri 3 av vevet. Definert som summen totalt celle-celle,-ECM og-oppløselige faktor interaksjoner, i tillegg til fysiske egenskaper, er mikromiljøet kompleks. De fenotyper av celler innenfor et vev er delvis på grunn av deres innhold genomisk og delvis grunnet de kombinatoriske interaksjoner med microenviroment. En stor utfordring er å knytte spesifikke kombinasjoner av microenvironmental komponenter med karakteristiske atferd.
ent "> Her presenterer vi mikromiljøet microarray (MEArray) plattform for celle-baserte funksjonell screening av interaksjoner med kombinatoriske microenvironments 4. Metoden gir mulighet for samtidig betjening av den molekylære sammensetningen og elastisitetsmodul, og kombinerer bruk av allment tilgjengelig microarray og micropatterning teknologier. MEArray skjermer krever så få som 10.000 celler per array, noe som letter funksjonelle studier av sjeldne celletyper som voksne stamceller. En begrensning av teknologien er at hele vev microenvironments kan ikke være helt rekapitulert på MEArrays. Men sammenligning av responser i samme celletype til en rekke relaterte microenvironments, for eksempel parvise kombinasjoner av ECM proteiner som karakteriserer en gitt vev, vil gi innsikt i hvordan microenvironmental komponenter lokke fram vevsspesifikke funksjonelle fenotyper.MEArrays kan skrives ved hjelp av et bredt utvalg av rekombinant growth faktorer, cytokiner, og renset ECM proteiner, og kombinasjoner derav. Plattformen er bare begrenset av tilgjengeligheten av spesifikke reagenser. MEArrays er mottagelig for tid-lapsed analyse, men oftest brukes til fastsat analyser av cellulære funksjoner som er målbare med fluorescerende prober. For eksempel, er DNA-syntese, apoptose, oppkjøp av differensierte stater, eller produksjon av spesifikke genprodukter vanligvis målt. Kort, er den grunnleggende flyt av en MEArray eksperiment for å forberede lysbilder belagt med utskrift undergrunn og å forberede master plate av proteiner som skal skrives ut. Da arrays skrives ut med en microarray robot, er celler lov til å feste, vokse i kultur, og deretter er kjemisk festet på nå eksperimentelle endepunkt. Fluorescerende eller kolorimetrisk analyser, fotografert med tradisjonelle mikroskop eller microarray skannere, brukes til å avsløre relevante molekylære og cellulære fenotyper (figur 1).
Protocol
Discussion
Den MEArray metoden presentert her gjør funksjonelle analyser av cellen og kombinatoriske mikromiljøet interaksjoner 4. MEArray analyse kombinerer bruk av grunnleggende micropatterning teknologier, cellebiologi og microarray utskrift roboter og analyse enheter som er tilgjengelige i mange flerbruker anlegg. MEArray skjermer er kompatible med de fleste adherente celletyper, selv serumfrie medier formuleringer kan måtte justeres i noen tilfeller å inkludere BSA eller <1% serum, som kan forbedre vedlegg. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML er støttet av NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og ved Laboratory Regi Forskning og Utvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
