Tillverkning och användning av mikromiljö microarrays (MEArrays)
Summary
En kombinatorisk funktionell screening metod för att få inblick i konsekvenserna av den molekylära sammansättningen av mikromiljöer på cellulära funktioner beskrivs. Metoden utnyttjar befintliga microarray-baserade tekniker för att generera matriser av definierade kombinatoriska mikromiljöer som stöder cellvidhäftning och funktionell analys.
Abstract
Samspelet mellan celler och deras omgivning mikromiljö har funktionella konsekvenser för cellulär beteende. På den enda cellnivå, kan distinkta mikromiljöer införa differentiering, migration och fenotyper spridning och på vävnadsnivå mikromiljön processer så komplicerat som morfogenes och tumorigenes 1. Inte bara cellen och molekylära innehåll mikromiljöer påverkar cellerna i, men det gör elasticiteten 2 och geometri 3 av vävnaden. Definieras som summan av cell-cell,-ECM och-lösliga interaktioner faktor, förutom fysiska egenskaper, är mikromiljön komplex. De fenotyper av celler inom en vävnad är delvis på grund av deras genomiska innehåll och delvis på grund av de kombinatoriska interaktioner med microenviroment. En stor utmaning är att koppla specifika kombinationer av microenvironmental komponenter med distinkta beteenden.
ENT "> Här presenterar vi mikromiljön microarray (MEArray) plattform för cellbaserad funktionell screening av interaktioner med kombinatoriska mikromiljöer 4. Metoden möjliggör samtidig styrning av molekylära sammansättning och elasticitetsmodul, och kombinerar användandet av allmänt tillgängliga microarray och micropatterning teknik. MEArray skärmar kräver så få som 10.000 celler per matris, vilket underlättar funktionella studier av sällsynta celltyper som vuxna stamceller. En begränsning av tekniken är att hela vävnad mikromiljöer kan inte helt rekapituleras på MEArrays. Men jämförelse av svar i samma celltyp till många relaterade mikromiljöer, t.ex. parvisa kombinationer av ECM-proteiner som kännetecknar en viss vävnad, kommer att ge insikter i hur microenvironmental komponenter framkallar vävnadsspecifika funktionella fenotyper.MEArrays kan skrivas ut med ett brett utbud av rekombinant growth faktorer, cytokiner, och renade ECM proteiner, och kombinationer därav. Plattformen är begränsad endast av tillgängligheten av specifika reagens. MEArrays är mottagliga för tiden löpt analys, men oftast används för analyser slutpunkt cellulära funktioner som är mätbara med fluorescerande prober. Till exempel är DNA-syntes, apoptos, förvärv av differentierade tillstånd, eller produktion av specifika genprodukter vanligen mäts. Kortfattat är det grundläggande flödet av en MEArray experiment för att förbereda bilder belagda med utskrift substrat och förbereda befälhavaren plattan av proteiner som ska skrivas ut. Sedan arrayer är tryckta med en microarray robot celler får fästa, växa i kultur, och sedan är kemiskt fixeras vid uppnående den experimentella slutpunkt. Fluorescerande eller kolorimetriska analyser, avbildas med traditionella mikroskop eller skannrar microarray, används för att avslöja relevanta molekylära och cellulära fenotyper (figur 1).
Protocol
Discussion
Den MEArray metoden som presenteras här ger funktionella analyser av cell-och kombinatoriska interaktioner mikromiljö 4. MEArray analys kombinerar användning av grundläggande micropatterning teknik, cellbiologi och microarray robotar utskrift och enheter analyser som finns i många flera användare anläggningar. MEArray skärmar är kompatibla med de flesta vidhäftande celltyper, fastän serumfria medier formuleringar kan behöva justeras i vissa fall inkludera BSA eller <1% serum, vilket kan förbä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML stöds av NIA (R00AG033176 och R01AG040081) och laboratoriet Riktat forskning och utveckling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
