Tredimensional Cell Culture Model for måling af virkningerne af interstitielvæske Flow på tumorcelleinvasion
Summary
Interstitiel fluid strømning er forhøjet i solide tumorer og kan modulere tumorcelleinvasion. Her beskriver vi en metode til at anvende interstitielt fluid strømning til celler indlejret i en matrix, og derefter måle deres virkning på celleinvasion. Denne teknik kan let tilpasses til at studere andre systemer.
Abstract
Vækst og udvikling af de fleste faste tumorer afhænger første transformation af cancerceller og deres reaktion på stroma-associeret signalering i tumormikromiljøet 1. Tidligere har forskningen på tumormikromiljøet primært fokuseret på tumor-stroma interaktion 1-2. Men tumormikromiljøet også omfatter en række biofysiske kræfter, hvis virkninger stadig dårligt forstået. Disse kræfter er biomekaniske følger tumorvækst, der fører til ændringer i genekspression, celledeling, differentiering og invasion 3. Matrixdensiteten 4, stivhed 5-6, og strukturen 6-7, interstitiel fluid tryk 8, og interstitiel fluidstrøm 8 ændres alle ved cancer progression.
Interstitiel fluid strømning i særdeleshed er højere i tumorer sammenlignet med normale væv 8-10. Den anslåede interstitielvæske flow hastigheder blev målt og fundet at være i området på 0,1-3 um s -1, afhængigt af tumorstørrelse og-differentiering 9, 11. Dette skyldes forhøjet interstitielt fluid tryk forårsaget af tumor-induceret angiogenese og forøget vaskulær permeabilitet 12. Interstitiel fluidstrøm har vist sig at forøge invasion af cancerceller 13-14, vaskulære fibroblaster og glatte muskelceller 15. Denne invasion kan skyldes autologe kemotaktiske gradienter skabt omkring celler i 3-D 16 eller forøget matrixmetalloproteinase (MMP) ekspression 15, chemokin sekretion og celleadhæsionsmolekyle ekspression 17. Imidlertid er den mekanisme, ved hvilken cellerne mærke fluidumstrøm ikke godt forstået. Ud over at ændre tumorcelle adfærd, modulerer interstitielt fluid strømning aktiviteten af andre celler i tumormikromiljøet. Det er associeret med (a) kørsel differentiering af fibroblaster i tumorfremmende myofibroblaster 18, (b) transport af antigener og andre opløselige faktorer til lymfeknuder 19, og (c) modulering lymfatiske endotelcelle morfogenese 20.
Den teknik, der præsenteres her medfører interstitiel fluidstrøm på celler in vitro og kvantificerer dens indvirkning på invasion (figur 1). Denne fremgangsmåde er blevet offentliggjort i flere undersøgelser til måling af virkningerne af fluidstrømmen på stromal og cancer celleinvasion 13-15, 17. Ved at ændre matrixsammensætning, celletype og cellekoncentrationen, kan denne metode anvendes til andre sygdomme og fysiologiske systemer til undersøgelse af virkningerne af interstitiel flow på cellulære processer, såsom invasion, differentiering, proliferation og genekspression.
Protocol
Discussion
Her har vi beskrevet en metode til at kvantificere virkningen af interstitiel flow på tumorcelleinvasion, under anvendelse af celler indlejret i en 3-D matrix i en cellekultur insert. Dette og lignende metoder er blevet anvendt til at undersøge virkningen af interstitiel strømning på en række celletyper 13-15, 17. Vores fremgangsmåde delvist efterligner matrix mikromiljø tumoren ved hjælp af type I collagen og Matrigel, som indeholder proteiner, der findes i basalmembranen af epitelvæv og omgiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
