Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l'écoulement des fluides interstitiels sur l'invasion tumorale
Summary
L'écoulement du fluide interstitiel est élevée dans les tumeurs solides et peut moduler l'invasion des cellules tumorales. Nous décrivons ici une technique d'appliquer l'écoulement du fluide interstitiel aux cellules noyées dans une matrice, puis de mesurer ses effets sur l'invasion des cellules. Cette technique peut être facilement adapté pour étudier d'autres systèmes.
Abstract
La croissance et la progression de la plupart des tumeurs solides dépendra de la transformation initiale des cellules cancéreuses et leur réponse aux stroma associé à la signalisation dans le microenvironnement de la tumeur 1. Auparavant, la recherche sur le microenvironnement de la tumeur s'est principalement concentrée sur la tumeur du stroma interactions 1-2. Toutefois, le microenvironnement tumoral comprend également une variété de forces, dont les effets biophysiques encore mal compris. Ces forces sont les conséquences biomécaniques de croissance de la tumeur qui entraînent des changements dans l'expression des gènes, la division cellulaire, la différenciation et l'invasion 3. La densité de la matrice 4, la raideur 5-6, et la structure 6-7, la pression du fluide interstitiel 8, et l'écoulement du fluide interstitiel 8 sont tous modifiés lors de la progression du cancer.
L'écoulement du fluide interstitiel en particulier est plus élevé dans les tumeurs par rapport à la normale 8-10 tissus. Le fl fluide interstitiel estiméevitesses oe ont été mesurés et jugés dans la gamme de 0,1-3 um s -1, en fonction de la taille tumorale et la différenciation 9, 11. Cela est dû à la pression du fluide interstitiel élevée causée par une tumeur induite par l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire accrue 12. L'écoulement du fluide interstitiel a été montré pour augmenter l'invasion des cellules cancéreuses 13-14, les fibroblastes et les cellules musculaires vasculaires lisses 15. Cette invasion peut être due à des gradients chimiotactiques autologues créés autour des cellules en 3-D 16 ou augmenté métalloprotéinases matricielles (MMP) l'expression 15, la sécrétion de chimiokines et de l'expression des molécules d'adhésion cellulaire 17. Cependant, le mécanisme par lequel les cellules détectent l'écoulement du fluide n'est pas bien comprise. En plus de modifier le comportement des cellules tumorales, l'écoulement du fluide interstitiel module l'activité d'autres cellules dans le microenvironnement tumoral. Il est associé à la différenciation de conduite (a) des fibroblastes en promotion de tumeurs myofibroblasts 18, (b) le transport des antigènes solubles et d'autres facteurs de ganglions lymphatiques 19, et (c) moduler la morphogenèse des cellules endothéliales lymphatique 20.
La technique présentée ici impose l'écoulement du fluide interstitiel sur des cellules in vitro et quantifie les effets sur l'invasion (figure 1). Cette méthode a été publié dans de nombreuses études pour mesurer les effets de l'écoulement du fluide sur stroma et l'invasion des cellules cancéreuses 13-15, 17. En changeant la composition de la matrice, le type de cellule, et la concentration cellulaire, cette méthode peut être appliquée à d'autres maladies et des systèmes physiologiques d'étudier les effets de l'écoulement interstitiel sur les processus cellulaires tels que l'invasion, la différenciation, la prolifération et l'expression des gènes.
Protocol
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthodologie pour quantifier l'effet de l'écoulement interstitiel sur l'invasion des cellules tumorales, en utilisant des cellules noyées dans une matrice 3-D au sein d'un insert de culture cellulaire. Méthodes et d'autres semblables ont été utilisés pour étudier l'effet de l'écoulement interstitiel sur une variété de types de cellules 13-15, 17. Notre approche reproduit partiellement le microenvironnement de la tumeur matrice en utilisant col…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
