Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых
Summary
Интерстициальный потока жидкости поднимается в твердых опухолях и могут модулировать опухолевой инвазии клеток. Здесь мы опишем технику применить интерстициальный потока жидкости в клетки встроены в матрицу, а затем измерить его воздействие на клетки вторжения. Этот метод может быть легко адаптирована для изучения других систем.
Abstract
Роста и прогрессирования наиболее солидных опухолей зависит от начальных преобразований раковые клетки и их реакции на строму связанных сигнализации в опухолевых микроокружения 1. Ранее исследования на опухоль микросреде была сосредоточена главным образом на стромальные опухоли взаимодействий 1-2. Тем не менее, опухоль микросреде также включает в себя различные биофизические силы, последствия которого остаются плохо. Эти силы биомеханического последствия роста опухоли, что приводит к изменениям в экспрессии генов, клеточного деления, дифференцировки и инвазии 3. Матрица плотности 4, жесткость 5-6, 6-7 и структуры, интерстициального давления жидкости 8, интерстициальный потока жидкости 8, все изменили в прогрессии рака.
Интерстициальный потока жидкости, в частности, выше в опухоли по сравнению с нормальными тканями 8-10. По оценкам интерстициальной жидкости этой скорости были измерены и признаны в диапазоне 0,1-3 мкм с -1, в зависимости от размера опухоли и дифференциации 9, 11. Это связано с повышенным давлением интерстициальной жидкости вызвано опухолью индуцированной ангиогенеза и повышенной проницаемостью сосудов 12. Интерстициальный потока жидкости было показано, что увеличение проникновение раковых клеток 13-14, сосудистые фибробластов и гладкомышечных клеток 15. Это вторжение может быть связано с аутологичной градиент хемотаксиса создали вокруг клетки в 3-D 16 или увеличение матрицы металлопротеиназы (ММП) выражение 15 секрецию хемокинов и молекул клеточной адгезии выражение 17. Тем не менее, механизм, посредством которого клетки чувствуют жидкости не очень хорошо понял. В дополнение к изменению поведения опухоли клетки, интерстициальные поток жидкости изменяет активность других клеток в опухоли микроокружения. Это связано с (а) вождение дифференциации фибробластов в опухоли содействия myofibrобласти 18, (б) транспортировки антигенов и других растворимых факторов, в лимфатические узлы 19, и (с) модуляции лимфатические эндотелиальные клетки морфогенеза 20.
Техники, представленные здесь накладывает интерстициальный потока жидкости на клетки в пробирке и количественно ее влияние на вторжение (рис. 1). Этот метод был опубликован в нескольких исследований для оценки воздействия жидкости на стромальные и вторжение раковых клеток 13-15, 17. При изменении состава матрицы, тип клеток и концентрации клеток, этот метод может быть применен к другим болезням и физиологических систем для изучения последствий внедрения потока на клеточных процессов, таких как вторжение, дифференцировке, пролиферации и экспрессии генов.
Protocol
Discussion
Здесь мы описали методику количественной оценки эффекта внедрения потока на инвазии опухоли клетки, используя встроенный клетки в 3-D матрица в течение вставки культуре клеток. Этот и подобные методы были использованы для изучения влияния внедрения потока на различные типы клеток, 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
