Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion
Summary
Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.
Abstract
Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren sind abhängig von der anfänglichen Transformation der Krebszellen und ihre Reaktion auf Stroma-assoziierten Signalmoleküle in der Tumor-Mikroumgebung 1. Bisher hat die Forschung auf die Tumor-Mikroumgebung in erster Linie auf die Tumor-Stroma-Interaktionen 2.1 konzentriert. Allerdings ist die Tumor-Mikroumgebung auch eine Vielzahl von biophysikalischen Kräfte, deren Wirkungen noch wenig verstanden. Diese Kräfte sind biomechanischen Folgen des Tumorwachstums, die zu Veränderungen in der Genexpression, Zellteilung, Differenzierung und Invasion 3 führen. Dichte-Matrix 4, Steifigkeit 5-6, 6-7 und Struktur, interstitielle Flüssigkeitsdruck 8, und der interstitiellen Flüssigkeit fließen 8 sind alle während der Tumorprogression verändert.
Interstitielle Fluidströmung insbesondere eine höhere Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe 8-10. Die geschätzte interstitiellen Flüssigkeit flow Geschwindigkeiten wurden gemessen und in dem Bereich von 0,1-3 um s -1, je nach Größe des Tumors und Differenzierung 9, 11. Dies ist aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes mit Tumor-induzierte Angiogenese und erhöhte Gefäßpermeabilität 12 hervorgerufen wird. Interstitielle Fluidströmung hat sich gezeigt, um das Eindringen von Krebszellen 13-14, vaskulären Fibroblasten und glatten Muskelzellen 15 erhöht wird. Dieses Eindringen kann auf autologen chemotaktische Gradienten um Zellen in 3-D 16 erzeugt oder erhöht Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression 15, Chemokin Sekretion und Expression Zelladhäsionsmolekül 17. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Zellen zu erfassen Fluidströmung nicht gut verstanden. Zusätzlich zu verändern Tumorzelle Verhalten moduliert interstitiellen Flüssigkeit fließen die Aktivität anderer Zellen in der Tumor-Mikroumgebung. Es ist mit (a) Fahren Differenzierung von Fibroblasten in tumorpromovierenden myofibr verbundenoblasts 18, (b) Transportieren von Antigenen und anderen löslichen Faktoren in Lymphknoten 19, und (c) Modulieren lymphatischen Endothelzellen Morphogenese 20.
Die hier vorgestellte Technik auferlegt interstitiellen Flüssigkeit fließen auf Zellen in vitro und quantifiziert deren Auswirkungen auf Invasion (Abbildung 1). Diese Methode wurde in mehreren Studien veröffentlicht worden, um die Auswirkungen der Strömung auf Stroma und die Invasion von Krebszellen 13-15, 17 zu messen. Durch Ändern der Matrix-Zusammensetzung, dem Zelltyp, und Zellkonzentration, kann dieses Verfahren auf andere Krankheiten und physiologische Systeme angewendet werden, um die Auswirkungen der interstitiellen Strömung auf zellulärer Prozesse, wie Invasion, Differenzierung, Proliferation und die Genexpression zu untersuchen.
Protocol
Discussion
Hier haben wir eine Methodik zur Quantifizierung der Wirkung der Strömung auf interstitielle Tumorzellinvasion, unter Verwendung von Zellen in einem 3-D-Matrix in einer Zellkultureinsatzes eingebetteten beschrieben. Diese und ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um die Wirkung der interstitiellen Strömung auf einer Vielzahl von Zelltypen 13-15, 17 studierst. Unser Ansatz teilweise imitiert die Matrix Mikroumgebung des Tumors mit Kollagen Typ I und Matrigel, die Proteine in der Basalmembran von E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
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