Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie
Summary
Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.
Abstract
De groei en progressie van solide tumoren meest afhangen van de eerste transformatie van de kankercellen en hun reactie op stroma-geassocieerde signalering in de tumor micro 1. Eerder heeft onderzoek gedaan naar de tumor micro-omgeving zich vooral gericht op de tumor-stroma interacties 1-2. Echter, de tumor micro-omgeving omvat ook een aantal biofysische krachten, waarvan de gevolgen nog steeds slecht begrepen. Deze krachten zijn biomechanische gevolgen van de groei van tumoren die leiden tot veranderingen in genexpressie, celdeling, differentiatie en invasie 3. Matrix dichtheid 4, stijfheid 5-6, en de structuur 6-7, interstitiële vloeistofdruk 8, en interstitiële vloeistofstroming 8 zijn allemaal veranderen tijdens de voortgang van kanker.
Interstitiële fluïdumstroom in het bijzonder hoger in tumoren ten opzichte van normale weefsels 8-10. De geschatte interstitiële vloeistof flow snelheden werden gemeten en in het gebied van 0,1-3 um en -1, afhankelijk tumorgrootte en differentiatie 9, 11. Dit is te wijten aan hoge interstitiële druk door tumor geïnduceerde angiogenèse-en verhoogde vasculaire permeabiliteit 12. Interstitiale fluïdum debiet is aangetoond invasie van kankercellen 13-14 vasculaire fibroblasten en gladde spiercellen 15 verhogen. Dit invasie kan het gevolg autologe chemotactische gradiënten die rond cellen 3-D 16 of meer matrix metalloproteinase (MMP) expressie 15 chemokine secretie en cell adhesion molecule expressie 17. Echter, het mechanisme waardoor cellen voelen stroming niet goed begrepen. Naast het veranderen van het gedrag van tumorcellen, interstitiële vloeistofstroming moduleert de werking van andere cellen in de tumor micro-omgeving. Het is gekoppeld met (een) rijden differentiatie van fibroblasten in tumor-bevorderende myofibroblasts 18 (b) transporteren van antigenen en andere oplosbare factoren lymfeknopen 19 en (c) moduleren lymfatische endotheelcellen morfogenese 20.
De techniek die hier stelt interstitiële vloeistofstroom op cellen in vitro en kwantificeert het effect ervan op invasie (figuur 1). Deze methode is gepubliceerd in meerdere studies het effect van de vloeistofstroom meten stromale en kankercel invasie 13-15, 17. Door de matrixsamenstelling, celtype en celconcentratie Deze methode kan worden toegepast op andere ziekten en fysiologische systemen om de effecten van interstitiële stroom bestuderen op cellulaire processen zoals invasie, differentiatie, proliferatie en genexpressie.
Protocol
Discussion
Hier hebben we beschreven een methode voor het kwantificeren van het effect van de interstitiële doorstroming op de tumorcel invasie, met behulp van cellen ingebed in een 3-D matrix in een cel cultuur insert. Deze en soortgelijke methoden toegepast om het effect van interstitiële stroom bestuderen op verschillende celtypen 13-15, 17. Onze aanpak bootst een deel van de matrix micro-omgeving van de tumor met behulp van type I collageen en Matrigel welke eiwitten in de basale membraan van het epitheel weefsel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
