Tredimensjonal Cell Kultur Modell for å måle effekten av interstitiell væske Flow på Tumor Cell Invasion
Summary
Interstitiell væskestrømmen er forhøyet i solide svulster og kan modulere tumor celle invasjon. Her beskriver vi en teknikk for å søke interstitiell væske strømme til celler innebygd i en matrise, og deretter måle dens virkninger på celle invasjon. Denne teknikken kan enkelt tilpasses til å studere andre systemer.
Abstract
Veksten og utviklingen av de fleste solide svulster avhenge første transformasjon av kreftceller og deres respons til stroma-assosiert signalering i svulsten mikromiljøet en. Tidligere har forskning på svulsten mikromiljøet fokusert primært på tumor-stromale interaksjoner 1-2. Omfatter imidlertid svulsten mikromiljøet også en rekke biofysiske krefter, og hvor virkningen er fortsatt dårlig forstått. Disse kreftene er biomekaniske konsekvenser av tumorvekst som fører til endringer i genuttrykket, celledeling, differensiering og invasjon tre. Matrix tetthet 4, stivhet 5-6, og struktur 6-7, interstitiell væske press 8, og interstitiell væske strømning 8 er alt endret under kreft progresjon.
Interstitiell væskestrømmen spesielt er høyere i svulster sammenliknet med normalt vev 8-10. Den estimerte interstitiell væske flow hastighetene ble målt og funnet å være i størrelsesorden 0,1 til 3 mikrometer s -1, avhengig tumor størrelse og differensiering 9, 11. Dette skyldes forhøyet interstitiell væske press forårsaket av tumor-indusert angiogenese og økt vaskulær permeabilitet 12. Interstitiell væskestrømmen er vist å øke invasjon av kreftceller 13-14, vaskulære fibroblaster og glatte muskelceller 15. Dette invasjon kan skyldes autologe kjemotaktisk gradienter skapt rundt cellene i 3-D 16 eller økt matrise metalloproteinase (MMP) uttrykk 15, chemokine sekret og celle adhesjonsmolekyl 17 uttrykk. Imidlertid er den mekanismen som cellene ane væskestrømmen ikke godt forstått. I tillegg til å endre tumor celle atferd, modulerer interstitiell strømning aktiviteten til andre celler i svulsten mikromiljøet. Det er forbundet med (a) kjøring differensiering av fibroblaster i tumor-fremme myofibroblasts 18, (b) transport av antigener og andre løselige faktorer til lymfeknuter 19, og (c) modulerende lymfatisk endotelcelle morphogenesis 20.
Teknikken som presenteres her pålegger interstitiell strømning på celler in vitro og kvantifiserer dens virkninger på invasjon (Figur 1). Denne metoden har blitt publisert i flere studier for å måle effekten av væskestrømmen på stromal og kreft celle invasjon 13-15, 17. Ved å endre matrisen sammensetning, celletype, og cellekonsentrasjonen, kan denne metoden brukes til andre sykdommer og fysiologiske systemer for å studere effekter av interstitiell flyt på cellulære prosesser som invasjon, differensiering, spredning, og genuttrykk.
Protocol
Discussion
Her har vi beskrevet en metodikk for å kvantifisere effekten av interstitiell flyt på tumor celle invasjon, ved hjelp av celler innebygd i en 3-D matrise inne i en celle kultur innsatsen. Dette og lignende metoder har blitt brukt til å studere effekten av interstitiell flyt på en rekke celletyper 13-15, 17. Vår tilnærming etterligner delvis matrisen mikromiljøet av svulsten ved hjelp av type I kollagen og Matrigel som inneholder proteiner som finnes i basalmembran av epitelvev og de omliggende st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
