Tredimensionell cellkulturmodell för mätning av effekterna av interstitialvätska Flow på Tumörcellinvasion
Summary
Interstitial vätska flöde är förhöjd i fasta tumörer och kan modulera tumörcellsinvasion. Här beskriver vi en metod att applicera interstitiell fluidflöde till celler inbäddade i en matris och sedan mäta dess effekt på cellinvasion. Denna teknik kan lätt anpassas för att studera andra system.
Abstract
Tillväxten och utvecklingen av de flesta solida tumörer är beroende på den initiala omvandlingen av cancerceller och deras svar på stroma-associerad signalering i tumören mikromiljö 1. Tidigare har forskning om tumören mikromiljö främst inriktad på tumör-stroma interaktion 1-2. Innehåller dock tumören mikromiljö också en mängd biofysiska krafter, vars effekter fortfarande dåligt kända. Dessa krafter är biomekaniska konsekvenser av tumörtillväxt som leder till förändringar i genuttryck, celldelning, differentiering och invasion 3. Matrix täthet 4, 5-6 styvhet och struktur 6-7, interstitialvätska tryck 8, och interstitiell vätskeflöde 8 är alla förändras under cancer progression.
Interstitial vätska strömmar i synnerhet är högre i tumörer jämfört med normala vävnader 8-10. Den beräknade interstitiell vätska flow hastigheter uppmättes och befanns vara i intervallet 0,1-3 | im s -1, beroende på tumörstorlek och differentiering 9, 11. Detta beror på förhöjd interstitiellt vätsketryck som orsakas av tumör-inducerad angiogenes och ökad vaskulär permeabilitet 12. Interstitial vätska strömma har visat sig öka invasion av cancerceller 13-14, vaskulära fibroblaster och glatta muskelceller 15. Denna invasion kan bero på autologa kemotaktiska gradienter skapas runt cellerna i 3-D-16 eller ökas matrix-metalloproteinas (MMP)-expression 15, kemokin sekretion och celladhesionsmolekyl uttryck 17. Emellertid är den mekanism genom vilken celler avkänna vätskeflödet inte väl förstådda. Förutom att förändra tumören cellbeteende, modulerar interstitiell fluidflöde aktiviteten hos andra celler i tumören mikromiljö. Det är förenat med (a) körning differentiering av fibroblaster i tumör-främjande myofibroblaster 18, (b) transport av antigener och andra lösliga faktorer till lymfkörtlar 19, och (c) modulering av lymfatiska endotelceller morfogenes 20.
Tekniken som presenteras här innebär interstitialvätska flöde på celler in vitro och kvantifierar dess effekter på invasion (figur 1). Denna metod har publicerats i flera studier för att mäta effekterna av vätskeflöde för stromal och cancer cellinvasion 13-15, 17. Genom att ändra matriskompositionen, celltyp och cellkoncentrationen, kan denna metod tillämpas på andra sjukdomar och fysiologiska system för att studera effekterna av interstitiell flöde på cellulära processer såsom invasion, differentiering, proliferation och genexpression.
Protocol
Discussion
Här har vi beskrivit en metod för att kvantifiera effekten av interstitiell flöde på tumörcellsinvasion, med användning av celler som är inbäddade i en 3-D-matris i en cellodling insatsen. Denna och liknande metoder har använts för att studera effekten av interstitiell flöde på ett antal olika celltyper 13-15, 17. Vårt tillvägagångssätt härmar delvis matrisen mikromiljö av tumören med hjälp av typ I kollagen och Matrigel som innehåller proteiner som finns i källaren membran epitelial vä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
