Hétérotypique tridimensionnelle<em> In Vitro</em> Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l'initiation et la progression du cancer des ovaires
Summary
Nous décrivons les méthodes pour établir<em> In vitro</em> Hétérotypiques modèles tridimensionnels comprenant des fibroblastes et la surface de l'ovaire ou de l'ovaire normale des cellules ovariennes cancéreuses épithéliales. Nous discutons de l'utilisation de ces modèles pour l'étude du stroma-épithéliales interactions qui se produisent au cours du développement du cancer de l'ovaire.
Abstract
Cancers épithéliaux de l'ovaire (COU) sont la principale cause de décès par cancer gynécologique dans les sociétés occidentales. Malgré les progrès dans les traitements chirurgicaux et l'amélioration des chimiothérapies à base de platine, il ya eu peu d'amélioration dans les taux de survie des COE pendant plus de quatre décennies 1,2. Bien que les tumeurs de stade I ont des taux de survie à 5 ans> 85%, les taux de survie pour le stade III / IV maladies sont <40%. Ainsi, les taux élevés de mortalité pour COE pourrait être considérablement diminué si les tumeurs ont été détectées au plus tôt, plus traitables les étapes 3-5. À l'heure actuelle, la base génétique moléculaire et biologique de stade de développement précoce de la maladie est mal comprise. Plus précisément, on sait peu au sujet du rôle du microenvironnement tumoral lors de l'initiation, mais les facteurs de risque connus pour la COU (par exemple l'âge et la parité) suggèrent que le microenvironnement joue un rôle clé dans la genèse précoce de la COU. Nous avons donc développé des modèles tridimensionnels hétérotypiquesà la fois de l'ovaire normal et du début des cancers de l'ovaire stade. Pour l'ovaire normal, nous co-cultivées surface épithéliale ovarienne normale (IOSE) et des fibroblastes du stroma normale (INOF) cellules, immortalisé par transduction retrovrial de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine holoenzyme (hTERT) pour prolonger la durée de vie de ces cellules en culture. Pour modéliser les premières étapes de la transformation cellulaire épithélial de l'ovaire, la surexpression de l'oncogène dans les cellules CMYC IOSE, nouveau co-cultivées avec des cellules INOF. Ces modèles hétérotypiques ont servi à étudier les effets du vieillissement et de la sénescence sur la transformation et l'invasion des cellules épithéliales. Ici, nous décrivons les étapes méthodologiques dans le développement de ces modèles en trois dimensions; ces méthodologies ne sont pas spécifiques au développement de l'ovaire normal et les tissus du cancer de l'ovaire, et pourrait être utilisée pour étudier les autres types de tissus où les interactions cellules stromales et épithéliales sont un élément fondamental aspect de l'entretien des tissus et didéveloppement malad.
Protocol
Discussion
La biologie du stade précoce de cancer ovarien épithélial (COE) est mal comprise. Peut-être l'un des principaux obstacles dans ce domaine depuis de nombreuses années a été le manque de compréhension des origines tissulaires spécifiques de la maladie, et de l'importance du rôle du microenvironnement dans le développement des COE. Au cours des dernières années, est devenu clair que des COE est une maladie hétérogène avec de multiples sous-types distincts histophathological, probablement avec diffé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été effectuée à la Keck School of Medicine, University of California, Etats-Unis, et l'University College London, Royaume-Uni. KL est financé par l'Institut national de la Santé subvention de 5 U19 CA148112-02. BG a été financé par une subvention de projet de la charité appel Eve oncologie gynécologique (Royaume-Uni). Certains de ces travaux entrepris à UCLH / UCL a été en partie le financement du ministère de la Santé INDH recherche biomédicale système de financement du Centre.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue Number |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 |
| PBS | VWR | 12001-766 |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 |
| Cell strainer (40 or 70 μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. . Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. e. M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer–shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
