Heterotypische Dreidimensionale<em> In Vitro</em> Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression
Summary
Wir beschreiben Methoden zur Gründung<em> In vitro</em> Heterotypische dreidimensionalen Modellen, umfassend ovariellen normalen Fibroblasten und Eierstock Oberfläche oder Eierstockkrebs Epithelzellen. Wir diskutieren den Einsatz dieser Modelle Stroma-Epithel-Interaktionen, die während Eierstockkrebs Entwicklung auftreten studieren.
Abstract
Epithelialen Eierstockkrebs (EOC) sind die häufigste Todesursache bei gynäkologischen Malignomen in westlichen Gesellschaften. Trotz der Fortschritte in der chirurgischen Behandlungen und verbesserten Platin-basierten Chemotherapie, hat es wenig Verbesserung EOC Überlebensraten für mehr als vier Jahrzehnten 1,2. Während im Stadium I Tumoren haben 5-Jahres-Überlebensraten> 85%, sind die Überlebensraten für Stufe III / IV der Krankheit <40%. So konnten die hohen Sterblichkeitsraten für EOC deutlich verringert werden, wenn die Tumore bei früheren, mehr behandelbar, Stufen 3-5 nachgewiesen wurden. Derzeit wird die molekulare genetische und biologische Grundlage der frühen Stadium der Erkrankung die Entwicklung nur unzureichend verstanden. Genauer gesagt, ist nur wenig über die Rolle der Mikroumgebung während Tumorinitiation bekannt, aber bekannten Risikofaktoren für EOC (zB Alter und Parität) legen nahe, dass die Mikroumgebung eine zentrale Rolle spielt in der frühen Entstehung der EOC. Wir entwickelten deshalb dreidimensionale heterotypische Modellesowohl der normalen Ovar und frühzeitig Eierstockkrebs. Für den normalen Ovar, wir co-kultivierten normalen Ovarien Oberflächenepithelzellen (IOSE) und normalen Stromazellen Fibroblasten (Inof) Zellen durch Transduktion retrovrial der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase Holoenzym (hTERT), um die Lebensdauer dieser Zellen in Kultur immortalisierten erstrecken. Um die frühesten Stadien der Ovarialepithelzellen Zelltransformation Überexpression des CMYC Onkogen in IOSE Zellen, wieder mit Inof Zellen co-kultiviert modellieren. Diese heterotypische Modelle wurden verwendet, um die Auswirkungen des Alterns und der Seneszenz der Transformation und Invasion von Epithelzellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die methodischen Schritte Entwicklung dieser dreidimensionalen Modells; diese Methoden sind nicht spezifisch für die Entwicklung einer normalen Ovar und Eierstockkrebs Geweben und könnte verwendet werden, um andere Gewebearten zu untersuchen, wo stromalen und epithelialen Zell-Wechselwirkungen sind ein grundlegendes Aspekt des Gewebes Wartung und diSease Entwicklung.
Protocol
Discussion
Die Biologie der Early-Stage-epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist wenig bekannt. Vielleicht eines der Haupthindernisse in diesem Bereich seit vielen Jahren war der Mangel an Verständnis für die Gewebe-spezifische Ursachen der Krankheit und die Bedeutung der Rolle der Mikroumgebung in EOC Entwicklung. In den letzten Jahren hat sich herausgestellt, dass sich EOC eine heterogene Erkrankung mit mehreren unterschiedlichen Subtypen histopathologischen, wahrscheinlich mit verschiedenen zellulären Ursprung für verschieden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde an der Keck School of Medicine, University of California, USA, und am University College London, UK durchgeführt. KL wird von National Institute of Health Gewährung 5 U19 CA148112-02 finanziert. BG wurde von einer Projektgruppe Zuschuss aus dem Eve Appeal gynäkologische Onkologie Charity (UK) finanziert. Einige dieser Arbeiten am UCLH / UCL durchgeführt wurde teilweise Finanzierung aus dem Department of Health NIHR Biomedical Research Centre Förderprogramm.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue Number |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 |
| PBS | VWR | 12001-766 |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 |
| Cell strainer (40 or 70 μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.
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