Гетеротипические Трехмерные<em> In Vitro</em> Моделирование Стромальные-эпителиальных взаимодействий во время посвящения яичников Рак и прогресс
Summary
Мы описываем методологии для установления<em> В пробирке</em> Гетеротипические трехмерных моделей содержащие яичников фибробластов и нормальной поверхности яичников или раком яичников эпителиальных клеток. Мы обсудим использование этих моделей для изучения стромальных-эпителиальных взаимодействий, которые происходят во время развития рака яичников.
Abstract
Эпителиального рака яичников (EOCs) являются ведущей причиной смерти от злокачественных гинекологических в западных обществах. Несмотря на успехи хирургического лечения и улучшения на основе платины химиотерапии, наблюдается небольшое улучшение в EOC выживаемость в течение более четырех десятилетий 1,2. В то время как I этап опухоли имеют 5-летнюю выживаемость> 85%, выживаемость этап III / IV заболевания <40%. Таким образом, высокий уровень смертности для EOC может быть существенно уменьшена, если опухоль была обнаружена на ранней, более поддающихся лечению, стадиях 3-5. В настоящее время молекулярно-генетические и биологические основы раннего развития стадии заболевания изучена плохо. В частности, мало известно о роли микроокружения опухоли во время посвящения; но известные факторы риска для EOCs (например, возраст и четности) предполагают, что микроокружение играет ключевую роль в начале генезиса EOCs. Поэтому мы разработали трехмерную гетеротипические моделейкак нормальный яичник и ранней стадии рака яичников. Для нормального яичника, мы совместно культивируемых нормальных поверхности яичников эпителиального (IOSE) и нормальных стромальных фибробластов (INOF) клетки, увековеченный retrovrial трансдукции каталитической субъединицы теломеразы человека холофермента (hTERT), чтобы продлить срок службы этих клеток в культуре. Для моделирования ранних стадиях яичников эпителиального трансформации клеток, избыточная экспрессия онкогена CMYC в IOSE клетки, опять совместно культивировали с INOF клеток. Эти гетеротипические модели были использованы для изучения влияния старения и старения на трансформации и вторжение в эпителиальных клетках. Здесь мы опишем методологические шаги в развитии этих трехмерных моделей; эти методики не являются специфическими для развития нормальной ткани яичников и рака яичников, и может быть использована для изучения других типов тканей, где стромальные и эпителиальные клетки взаимодействия являются фундаментальными аспектом поддержания тканей и ди-Сиз развития.
Protocol
Discussion
Биология ранней стадии эпителиального рака яичников (EOC) еще плохо изучены. Возможно, одним из основных препятствий в этой области на протяжении многих лет было отсутствие понимания ткани конкретные истоки болезни, и о значимости роли микроокружения в EOC развития. За последние нескольк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было выполнено в Кек Школы медицины Университета Калифорнии, США, и Университетского колледжа в Лондоне, Великобритания. KL финансируется Национальным институтом здравоохранения гранта 5 до 19 лет CA148112-02. BG был профинансирован проект грант от Апелляционного Ева гинекологической онкологии благотворительность (Великобритания). Часть этой работы, проделанной на UCLH / UCL был частично финансируется Департаментом здравоохранения NIHR биомедицинских исследований схему финансирования центра.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalogue Number |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 |
| PBS | VWR | 12001-766 |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 |
| Cell strainer (40 or 70 μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. . Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. e. M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer–shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
