Summary

Heterotypisk Tredimensionell<em> In Vitro</em> Modellering av Stromal-Epithelial interaktioner Under äggstockscancer Inledande och progression

Published: August 28, 2012
doi:

Summary

Vi beskriver metoder för att fastställa<em> In vitro</em> Heterotypiska tredimensionella modeller består äggstockarna fibroblaster och normala äggstockar yta eller äggstockscancer epiteliala celler. Vi diskuterar användningen av dessa modeller för att studera stromal-epiteliala samspel som sker under äggstockscancer utveckling.

Abstract

Epitelial äggstockscancer (EOCs) är den vanligaste orsaken till död i gynekologisk malignitet i västerländska samhällen. Trots framsteg inom kirurgiska behandlingar och förbättrade platinabaserade kemoterapi, har det varit lite förbättring i EOC överlevnad för mer än fyra decennier 1,2. Samtidigt steg I tumörer har 5-årsöverlevnaden> 85%, överlevnad för steg III / IV sjukdom är <40%. Således kunde den höga dödligheten för EOC avsevärt minskas om tumörer upptäcktes vid tidigare, mer behandlingsbara, steg 3-5. För närvarande är den molekylära genetiska och biologiska grunden för tidigt sjukdomens utveckling dåligt förstådd. Mer specifikt är lite känt om den roll som mikromiljön vid tumörinitiering, men kända riskfaktorer för EOCs (t.ex. ålder och paritet) tyder på att mikromiljön spelar en nyckelroll i den tidiga uppkomsten av EOCs. Vi utvecklade därför tredimensionella heterotypiska modellerav både normal äggstock och tidigt stadium äggstockscancer. För den normala äggstocken, samarbetar vi odlade normala äggstockar yta epitelial (IOSE) och normal stromal fibroblast (INOF) celler, som förevigats av retrovrial transduktion av den katalytiska subenheten av humant telomeras holoenzym (hTERT) för att förlänga livslängden på dessa celler i kultur. Att modellera de tidigaste stadierna av äggstockarna epitelceller omvandling, överuttryck av CMYC onkogen i IOSE celler, återigen samodlas med INOF celler. Dessa heterotypiska modeller användes för att undersöka effekterna av åldrande och åldrande på omvandling och invasion av epitelceller. Här beskriver vi de metodologiska stegen i utvecklingen av dessa tredimensionella modell, dessa metoder är inte specifika för utvecklingen av normala äggstockar och äggstockscancer vävnad cancer, och kan användas för att studera andra vävnadstyper där stromala och epiteliala cell interaktioner är en grundläggande aspekt av vävnaden underhåll och di-sjukdomsbekämpning utveckling.

Protocol

Figur 1 illustrerar en översikt av arbetsflödet som beskrivs nedan. 1. Isolering av normala äggstockarna fibroblaster och förlängning av in vitro livslängd med Överuttryck av den katalytiska subenheten av hTERT holoenzym Ovarian vävnader kan samlas med informerad patient samtycke och godkännande av Institutional Review Board (för amerikanska institutioner). Normala äggstockarna vävnader kan samlas efter total abdominal hysterektomi el…

Discussion

Biologi tidig epitelial äggstockscancer (EOC) är dåligt känd. Kanske en av de största hindren på detta område under många år har varit bristen på förståelse för vävnadsspecifika ursprung sjukdomen, och av betydelsen av den roll som mikromiljön i EOC utveckling. Under de senaste åren har har blivit tydligt att EOC är en heterogen sjukdom med flera olika histophathological subtyper, förmodligen med olika cellulära ursprung för olika subtyper. Till exempel de aktuella data tyder på att hög kvalitet se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning utfördes vid Keck School of Medicine, University of California, USA, och University College London, Storbritannien. KL finansieras av National Institute of Health bidrag 5 U19 CA148112-02. BG har finansierats av ett projekt bidrag från Eva Appeal gynekologisk onkologi välgörenhet (Storbritannien). En del av detta arbete bedrivs på UCLH / UCL delvis finansiering från Department of Health: s NIHR biomedicinsk forskning Centre stödordning.

Materials

Reagent Supplier Catalogue Number
PolyHEMA, suitable for cell culture Sigma Aldrich P3932
Molecular biology grade ethanol Sigma Aldrich E7023
Sterile water for cell culture VWR 12001-356
MCDB105 Sigma Aldrich M6395
Medium 199 Sigma Aldrich M2154
Hyclone Fetal bovine serum Thermo Scientific SH30088.03
Gentamicin Sigma Aldrich G1397
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942
pBABE-hygro-hTERT Addgene 1773
PBS VWR 12001-766
0.25% trypsin-EDTA Invitrogen 25200-072
Cell strainer (40 or 70 μm) VWR 21008-949
21008-952
Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 Sigma F4771
Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) Santa Cruz sc-8018
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma 107689
TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS Roche 12013789001
TeloTAGGG Telomere Length Assay Roche 12209136001

Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study.

References

  1. Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
  2. Office for National Statistics. . Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , (2011).
  3. Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
  4. Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
  5. Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
  6. Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
  7. Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
  8. Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
  9. Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
  10. Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
  11. Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
  12. Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
  13. Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
  14. Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
  15. Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
  16. Kurman, R. J., Shih, I. e. M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer–shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
check_url/4206?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Lawrenson, K., Grun, B., Gayther, S. A. Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression. J. Vis. Exp. (66), e4206, doi:10.3791/4206 (2012).

View Video