Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie
Summary
We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling onderzocht<em> In vivo</em> Behulp van genetisch gemanipuleerde muizen op een wildtype of T-celreceptor transgene achtergrond.
Abstract
Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl de resterende tolerant voor zelf-antigenen. Willekeurige herschikking van de T cel receptor (TCR) α en β loci genereert een T cel repertoire met enorme diversiteit in antigeenspecificiteit, zowel zelf als buitenlandse. Selectie van het repertoire tijdens de ontwikkeling in de thymus is cruciaal voor het genereren veilige en nuttige T-cellen. Defecten in thymus selectie bijdragen tot de ontwikkeling van auto-en immunodeficiëntie aandoeningen 1-4.
T cel voorlopers voer de thymus als dubbele negatieve (DN) thymocyten die geen expressie CD4 of CD8 coreceptoren. Expressie van het αβTCR en beide co-receptoren optreedt bij de dubbele positieve (DP) podium. Interactie van de αβTCR met zelf-peptide-MHC (pMHC) door thymus cellen bepaalt het lot van de DP thymocyten. Hoge affiniteit interacties leiden tot negatieve selectie en opheffingtie van zelfontledende thymocyten. Lage affiniteit interacties resulteren in positieve selectie en ontwikkeling van CD4 of CD8 enkele positieve (SP) T-cellen herkent vreemde antigenen gepresenteerd door zelf-MHC 5.
Positieve selectie kan worden onderzocht in muizen met een polyklonaal (wildtype) TCR repertoire door het observeren van de generatie van rijpe T-cellen. Zij zijn echter niet geschikt voor de studie van negatieve selectie, die kleine deletie van antigeen-specifieke populaties omvat. Veel modelsystemen zijn gebruikt om negatieve selectie bestuderen maar in hun vermogen om vatten fysiologische gebeurtenissen 6 verschillen. Bijvoorbeeld, in vitro stimulatie van thymocyten mist de thymus omgeving die nauw betrokken is bij selectie, terwijl toediening van exogeen antigen kan leiden tot niet-specifieke deletie van thymocyten 7-9. Op dit moment, de beste tools voor het bestuderen van in vivo negatieve selectie zijn muizen die een transg drukkenENIC TCR specifiek voor endogene zelf-antigeen. Echter, veel klassieke TCR transgene modellen gekenmerkt door premature expressie van het transgene TCRα ketting aan de DN, resulterend in premature negatieve selectie. Ons laboratorium ontwikkelde de HY cd4 model, waarbij de transgene HY TCRα voorwaardelijk wordt aan het DP stadium, waardoor negatieve selectie in de DP optreden SP overgang zoals bij wildtype muizen 10.
Hier beschrijven we een flowcytometrie-based protocol thymus positieve en negatieve selectie onderzoeken de HY cd4 muismodel. Terwijl negatieve selectie in HY CD4 muizen zeer fysiologische Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere TCR transgene modellen. We brengen u ook algemene strategieën voor het analyseren van positieve selectie in een polyklonaal repertoire van toepassing op alle genetisch gemanipuleerde muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie in niet-transgene en TCR TCR transgene muizen onderzocht. Dit protocol beschrijft de kleuring van oppervlakte-antigenen. Voor verdere analyse van moleculaire mechanismen, is het vaak noodzakelijk om intracellulaire kleuring uitgevoerd. We maken gebruik van de BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit voor de meeste intracellulaire eiwitten en de BD Biosciences Foxp3 Staining Kit voor transcriptiefactoren. We meestal verkrijgen onze monste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Bing Zhang bedanken voor zijn technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB is een CIHR New Investigator en AHFMR Scholar. QH wordt ondersteund door een CIHR Canada Graduate Scholarship – Doctoral en een AIHS Voltijds studententijd. SAN wordt ondersteund door een Koningin Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS wordt ondersteund door een NSERC Postgraduate Scholarship – Doctoral.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
