Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie
Summary
Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu untersuchen<em> In vivo</em> Mit genetisch manipulierten Mäusen auf einer Wildtyp-oder T-Zell-Rezeptor transgenen Hintergrund.
Abstract
Ein gesundes Immunsystem verlangt, dass T-Zellen fremde Antigene reagieren, während verbleibenden tolerant gegenüber Selbst-Antigenen. Random Umlagerung der T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β loci erzeugt eine T-Zell-Repertoire mit riesigen Vielfalt in Antigenspezifität, sowohl sich selbst als auch ausländische. Auswahl des Repertoires während der Entwicklung im Thymus ist kritisch für die Erzeugung und sichere nützlich T-Zellen. Defekte im Thymus Auswahl zur Entwicklung von Autoimmun-und Immunschwäche-Erkrankungen 1-4.
T-Zell-Vorläufer geben den Thymus als doppelt negative (DN) Thymozyten, die nicht exprimieren CD4 oder CD8 Co-Rezeptoren. Expression des αβTCR und beide Co-Rezeptoren tritt bei der doppelt positiven (DP) Bühne. Interaktion des αβTCR mit Selbst-Peptid-MHC (pMHC) durch Thymus-Zellen präsentiert bestimmt das Schicksal der DP Thymozyten. Hochaffine Wechselwirkungen zu negativen Selektion und Eliminierung führention von selbst-reaktiven Thymozyten. Low Affinitätswechselwirkungen Ergebnis in positiver Selektion und Entwicklung von CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) T-Zellen in der Lage zu erkennen fremde Antigene durch Selbst-MHC 5 dargestellt.
Positive Selektion kann in Mäusen mit einem polyklonalen (Wildtyp) TCR Repertoires werden durch Beobachten der Erzeugung von reifen T-Zellen untersucht. Sie sind jedoch nicht ideal für das Studium der negativen Selektion, die Deletion von antigenspezifischen kleinen Populationen umfasst. Viele Modellsysteme verwendet worden, um negative Selektion zu studieren, aber variieren in ihrer Fähigkeit zu rekapitulieren physiologische Ereignisse 6. Zum Beispiel in-vitro-Stimulation von Thymozyten fehlt die Thymus-Umgebung, die innig in Auswahl beteiligt ist, während Verabreichung von exogenen Antigens an nicht-spezifische Deletion von Thymozyten 7-9 führen kann. Derzeit sind die besten Werkzeuge für die Untersuchung in vivo negative Selektion Mäuse, die eine transg ausdrückenenic TCR spezifisch für endogene Selbst-Antigen. Allerdings sind viele klassischen TCR-transgene Modelle von vorzeitigem Expression des transgenen TCRα Kette am DN Stufe dadurch, was zu einem vorzeitigen negative Selektion. Unser Labor hat den HY cd4 Modell, bei dem der transgene HY TCRα bedingt am DP Stufe exprimiert wird entwickelt, wodurch negative Selektion während der DP bis SP Übergang auftreten wie dies bei Wildtyp-Mäusen 10.
Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll zum Thymus positive und negative Selektion in der HY cd4 Mausmodell zu untersuchen. Während negative Auswahl HY cd4 Mäusen ist höchst physiologischen können diese Verfahren auch auf andere TCR-transgene Modelle angewendet werden. Wir werden außerdem allgemeine Strategien zur Analyse positive Selektion in einem polyklonalen Repertoire für alle genetisch manipulierten Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll kann verwendet werden, um positive und negative Selektion in nicht-transgenen und TCR TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Färbung von Oberflächen-Antigenen. Für die weitere Analyse der molekularen Mechanismen, ist es oft notwendig, intrazelluläre Färbung führen. Wir verwenden die BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit für die meisten intrazellulären Proteinen und der BD Biosciences Foxp3 Staining Kit für Transkriptionsfaktoren. Wir in der Regel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Bing Zhang für seine technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute for Health Research (MOP-86595) finanziert. TAB ist eine CIHR New Investigator und AHFMR Scholar. Doctoral und einem AIHS Vollzeit Studentship – QH wird durch eine CIHR Canada Graduate Scholarship unterstützt. SAN wird von einer Königin Elizabeth II Graduate Scholarship unterstützt. Doctoral – AYWS wird durch ein NSERC Postgraduate-Stipendium unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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