유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험
Summary
우리는 T 세포 개발을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반 방법을 제시<em> 생체 내</em> wildtype 또는 T 세포 수용체 유전자 변형 배경에 유전자 조작 쥐를 사용합니다.
Abstract
건강한 면역 체계가 자기 항원에 허용 남아있는 동안 T 세포가 외국 항원에 반응해야합니다. T 세포 수용체 (TCR) α와 β loci의 무작위 다시 정리하기는 자신과 외국에 모두 항원 특이성의 광대 한 다양성과 T 세포 레퍼토리를 생성합니다. thymus에서 개발 중에 레퍼토리의 선택은 안전하고 유용한 T 세포를 생성 중요합니다. thymic 선택에 결함이 면역과 면역 결핍 장애 1-4의 발전에 기여하고 있습니다.
T 세포 progenitors은 CD4 또는 CD8 공동 수용체를 표현하지 않는 2 중 부정 (DN) thymocytes로 thymus를 입력합니다. αβTCR하고 두 공동 수용체의 표현은 '더블 긍정적 (DP) 단계에서 발생합니다. 자기 펩타이드-MHC (pMHC) thymic 세포에서 제공과 αβTCR의 상호 작용은 DP의 thymocyte의 운명을 결정합니다. 높은 연관성 상호 작용은 부정적인 선택과 elimina로 연결자기 반응성 thymocytes의 기. CD4 또는 자기 MHC (5)에 의해 제시 외국 항원을 인식 할 수 CD8 하나의 긍정적 인 (SP) T 세포의 긍정적 인 선택과 개발에 낮은 친화 상호 작용 결과.
긍정적 인 선택은 성숙 T 세포의 생성을 관찰하여 polyclonal (wildtype) TCR의 레퍼토리와 마우스에서 공부 할 수 있습니다. 그러나, 작은 항원 특정 인구의 삭제를 포함 부정적인 선택의 연구에 적합하지 않습니다. 대부분의 모델 시스템은 부정적인 선택을 공부하지만, 생리 이벤트에게 6 요점을 되풀이하는 능력에 따라 다를하는 데 사용되었습니다. 외인성 항원의 행정 thymocytes 7-9의 비 특정 삭제 될 수 있습니다 예를 들어, thymocytes의 체외 자극에 깊은 선택에 관여 thymic 환경을 부족합니다. 현재 생체 부정적인 선택에서 공부에 가장 적합한 도구 transg을 표현할 마우스 아르자기 항원 내생에 enic TCR의 특정. 그러나 많은 고전 TCR 유전자 변형 모델은 조기 부정적인 선택의 결과로, DN 단계에서 유전자 변형 TCRα 체인의 조기 표현을 특징으로하고 있습니다. 우리 연구소는 10 wildtype 마우스에서 발생하는 부정적인 선택 SP 전환에 DP 동안 발생 할 수 있습니다 유전자 변형 HY TCRα이 조건 DP 단계에서 표현되는 HY의 CD4 모델을 개발했습니다.
여기, 우리는 HY의 CD4 마우스 모델에서 thymic 긍정적이고 부정적인 선택을 검토 할 수있는 흐름 세포 계측법 기반의 프로토콜을 설명합니다. HY의 CD4 마우스의 부정적인 선택이 매우 생리이지만,이 방법은 다른 TCR 유전자 변형 모델에도 적용 할 수 있습니다. 우리는 또한 유전자 조작 마우스에 적용 polyclonal 레퍼토리에 긍정적 인 선택을 분석하는 일반적인 전략을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 비 TCR 유전자 변형과 TCR 유전자 변형 마우스의 양수와 음수 선택을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원의 착색에 대해 설명합니다. 분자 메커니즘의 추가 분석을 위해, 그것은 종종 세포 염색법을 수행 할 필요가 있습니다. 우리는 전사 인자 대부분의 세포 내 단백질과 BD Biosciences의 Foxp3의 얼룩 키트의 BD Biosciences Cytofix / Cytoperm 키트를 사용합니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 기술 지원을 빙 장을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구 (걸레-86595)에 대한 캐나다 연구소에 의해 자금을 지원했다. TAB는 CIHR 새로운 탐정과 AHFMR 학술 수 있습니다. 박사와 AIHS 풀 타임 학생이기 – QH는 CIHR 캐나다 대학원 장학금으로 지원됩니다. SAN은 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금으로 지원됩니다. 박사 – AYWS는 NSERC 대학원 장학금으로 지원된다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
