Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi
Summary
Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sunmak<em> In vivo</em> Bir yabani-tip veya T hücre reseptörü transgenik arka plan üzerinde genetik manipüle fare kullanarak.
Abstract
Sağlıklı bir bağışıklık sistemi kendi antijenlerine tolerans kalırken T hücrelerinin yabancı antijenleri yanıt gerektirir. T hücre reseptör (TCR) α ve β lokusların Rastgele düzenlenmesi öz ve yabancı hem antijen özgüllüğü engin çeşitliliği ile T hücre repertuarı oluşturur. Timusta gelişimi sırasında repertuar seçimi güvenli ve kullanışlı T hücreleri üretmek için önemlidir. Timik seçiminde Kusur otoimmün ve immün bozuklukları 1-4 gelişmesine katkıda bulunur.
T hücre progenitörler CD4 veya CD8 co-reseptörleri ifade etmezler çift negatif (DN) timositleri olarak timus girin. ΑβTCR hem eş-reseptör ekspresyonu çift pozitif (DP) aşamada gerçekleşir. Öz-peptid-MHC (pMHC) timus hücreleri tarafından sunulan ile αβTCR Etkileşimi DP timosit kaderini belirler. Yüksek afinite etkileşimleri olumsuz seçimi ve ortadan kalk yolkendinden reaktif timositlerin tion. CD4 veya kendinden MHC 5 tarafından sunulan yabancı antijenleri tanıma yeteneğine CD8 tek pozitif (SP) T hücrelerinin pozitif seçimi ve gelişimi Düşük afinite etkileşimleri sonucu.
Pozitif Seçimi olgun T hücrelerinin üretimi gözlemleyerek bir poliklonal (yabani-tip) TCR repertuarı ile farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerir negatif seçim çalışma için ideal değildir. Birçok model sistemler negatif seçim çalışma ama fizyolojik olaylar 6 özetlemek için yeteneklerini değiştirmek için kullanılan edilmiştir. Eksojen antijen uygulamasından timositlerde 7-9 non-spesifik silme yol açabilir Örneğin, timositlerde in vitro uyarımı olarak, iç içe işlemine dahil olan timik ortam yoksundur. Şu anda, in vivo negatif seleksiyon eğitim için en iyi araçları bir transgresyon ifade fareler vardırself-antijen endojen için ENIC TCR özgü. Bununla birlikte, birçok klasik TCR transjenik modelleri prematüre negatif seçim ile sonuçlanan, DN aşamada transgenik TCRα zincirinin erken ifade ile karakterize edilir. Bizim laboratuvar olarak 10 yabani-tip farelerden oluşan negatif seleksiyon SP geçiş DP sırasında meydana sağlayan, transgenik HY TCRα şartlı DP aşamada ifade edildiği HY cd4 model geliştirdi.
Burada, HY cd4 fare modelinde timik pozitif ve negatif seçim incelemek için bir akış sitometri tabanlı protokol açıklar. HY CD4 farelerde, negatif seleksiyon çok fizyolojik olmakla birlikte, bu yöntemlerin diğer TCR transjenik modelleri ile de uygulanabilir. Biz de herhangi bir genetik manipüle fare için geçerli bir poliklonal repertuar olumlu seçimi analiz için genel stratejiler sunacak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol olmayan TCR transjenik ve TCR transgenic farelerde pozitif ve negatif seçim incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, yüzey antijenlerinin boyama açıklanmaktadır. Moleküler mekanizmalarının daha fazla analiz için, genellikle hücre içi boyama yapmak için gereklidir. Biz transkripsiyon faktörleri için en intraselüler proteinler ve BD Biosciences Foxp3 Boyama Seti BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kiti kullanın. Biz genellikle hemen boyama sonra örnekleri kazanır. Bununla birli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kendi teknik yardım için Bing Zhang teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (MOP-86595) için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. SEKME CIHR Yeni Araştırmacı ve AHFMR Scholar olduğunu. Doktora ve AIHS Tam zamanlı Bursu – HY bir CIHR Kanada Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. SAN Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir. Doktora – AYWS bir NSERC Lisansüstü Burs tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
