בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry
Summary
אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T<em> In vivo</em> באמצעות מניפולציות גנטיות בעכברי wildtype או רקע רצפטור תא T מהונדס.
Abstract
מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים 1-4.
אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי 5-MHC עצמי.
סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים 6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes 7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype 10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לינג ג'אנג לסיוע הטכני שלו. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-86595). TAB הוא ניו חוקר ומלומד CIHR AHFMR. QH נתמך על ידי מלגת CIHR קנדה למוסמכים – דוקטורנטים וStudentship AIHS במשרה מלאה. SAN נתמך על ידי מלגת מלכת אליזבת השנייה בוגר. AYWS נתמך על ידי מלגות לתארים מתקדמים NSERC – דוקטורט.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
