Summary
Procédé d'observation des molécules d'ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d'une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d'ingénierie dans l'ADN d'intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.
Abstract
Peu de plasmides d'origine naturelle sont maintenus dans des cellules de mammifères. Parmi ceux-ci sont des génomes des herpèsvirus gamma, y compris les virus Epstein-Barr (EBV) et sarcome de Kaposi associé au virus de l'herpès (KSHV), qui provoquent de multiples tumeurs malignes humaines 1-3. Ces deux génomes sont répliquées de manière licence, chacun utilisant une seule protéine virale et de la machinerie de réplication cellulaire, et sont transmis aux cellules filles lors de la division cellulaire en dépit de leurs centromères traditionnels manquent 4-8.
Beaucoup de travail a été fait pour caractériser les répliques de ces génomes plasmidiques en utilisant des méthodes telles que transfert de Southern et hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces méthodes sont limitées, cependant. PCR quantitative et transferts de Southern fournir des informations sur le nombre moyen de plasmides par cellule dans une population de cellules. FISH est un test unicellulaire qui révèle à la fois le nombre et la répartition moyenne de plasmide s par cellule dans la population de cellules, mais est statique, ce qui permet pas d'informations sur la société mère ou la descendance de la cellule examinée.
Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser plasmides dans des cellules vivantes. Cette méthode est basée sur la liaison d'une protéine fluorescente marqués répresseur lactose à des sites multiples dans le plasmide d'intérêt 9. L'ADN d'intérêt est conçu pour inclure environ 250 répétitions en tandem de l'opérateur lactose (lacO) séquence. LacO est spécifiquement lié par la protéine répresseur lactose (LACI), qui peut être fusionnée à une protéine fluorescente. La protéine de fusion peut être exprimée à partir du plasmide génétiquement ou introduit par un vecteur rétroviral. De cette façon, les molécules d'ADN sont marqués par fluorescence et deviennent donc visibles par microscopie à fluorescence. La protéine de fusion est bloquée de lier l'ADN plasmidique par culture de cellules en présence d'IPTG jusqu'à ce que les plasmides sont prêtes à être visualisées.
ontenu "> Ce système permet aux plasmides à surveiller dans les cellules vivantes à travers plusieurs générations, révélant les propriétés de leur synthèse et de partitionnement aux cellules filles. Idéal cellules sont adhérentes, facilement transfectées, et ont de gros noyaux. Cette technique a été utilisée pour déterminer que 84% de l'EBV plasmides dérivés sont synthétisés chaque génération et 88% de la partition nouvellement synthétisé plasmides fidèlement aux cellules filles dans des cellules HeLa. Paires de ces plasmides EBV ont été vus pour être attachés ou associés à chromatides sœurs après leur synthèse dans S- phase jusqu'à ce que ils ont été vus pour séparer les chromatides sœurs séparés dans Anaphase 10. La méthode est actuellement utilisée pour étudier la réplication des génomes KSHV dans des cellules HeLa et les cellules SLK. cellules HeLa sont immortalisés cellules épithéliales humaines, et les cellules sont immortalisées SLK endothéliales humaines cellules. Bien que les cellules SLK ont été à l'origine dérivé d'une lésion KSHV, ni la lignée cellulaire HeLa, ni SLK naturellement harbeurs génomes KSHV 11. En plus d'étudier la réplication virale, cette technique de visualisation peut être utilisée pour étudier les effets de l'ajout, la suppression ou la mutation des divers éléments de séquence d'ADN sur la synthèse, la localisation et le partitionnement des autres recombinantes ADN plasmidiques.Protocol
1. Ingénierie des cellules avec des plasmides visibles
- Utilisez une digestion de restriction standard ou techniques de recombinaison homologue pour introduire un fragment d'ADN contenant environ 250 copies de la séquence opérateur lactose (LACO) dans le plasmide pour être visualisées. Notre plasmide est un bacmide d'environ 170 kpb et contenant le génome complet de sarcome de Kaposi associé au virus de l'herpès (KSHV) et la résistance à l'hygromycine codé 12.
- Présentez-Laco contenant de l'ADN plasmidique dans les cellules de mammifères par transfection avec Lipofectamine 2000. Nous avons transfecté des cellules HeLa et SLK en boîtes de 60 mm pour 4 h avec 10 ug d'ADN plasmidique purifié avec 25 ul de Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, et 3,5 ml de DMEM.
- Changer le milieu de culture à 5 ml de DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin cellules et incuber pendant 48 h.
- Plaque les cellules à faible densité dans de grands plats et des cellules de culture dans un milieu contenant un antibiotique de sélection pour l'introduction plasmid; nous avons sélectionné les cellules dans du DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal avec 300 pg / ml d'hygromycine pendant 3 semaines.
- Utilisez des morceaux de stériles, la trypsine imbibé de papier filtre pour transférer hygromycine colonies résistantes à de nouvelles boîtes de culture.
- Lorsque clones transfectés sont cultivés à remplir le récipient métallique, pour isoler l'ADN digestion de restriction et de Southern blot en sorte que le polymère du plasmide lacO est homogène et de la taille attendue.
- Si le plasmide n'a pas été modifié pour exprimer une fusion de LacI, infecter clones appropriés avec un rétrovirus codant pour le répresseur lactose (LACI) fusionné à une protéine fluorescente rouge, comme LacI-tdTomato. Nous utilisons tdTomato plutôt que de protéines qui sont fluorescents rapprocher au vert pour réduire photoxicity qui se produirait à partir de multiples expositions plus longues durées 13.
- Une fois la protéine de fusion est introduite LacI, la culture des cellules en présence de 200 ug / ml d'isopropyl-bD-galactoside (IPTG) pour bloquer les protéines de fusion de liaisonADN.
- Culture des cellules pendant au moins 3 jours pour permettre l'expression de la protéine LacI-tdTomato.
- Clones écran (en emportant l'IPTG et la visualisation des cellules comme décrit ci-dessous) pour les personnes ayant des niveaux optimaux de LacI-tdTomato qui révèlent signaux distincts avec des niveaux de fond minimal de protéine de fusion non liée.
2. Développement du système d'imagerie
Notre système d'imagerie se compose d'un Zeiss Axiovert 200M équipé d'une platine motorisée et le Plan-Aochromat 63x/1.4 objectif huile. La lumière d'excitation de fluorescence est fourni par le "blanc neutre" d'un système de LED Colibri. D'émission est détecté par une CascadeII: 1024 EMCCD caméra. Il s'agit d'un refroidissement, la caméra de recul dilué avec un registre de gain pour amplifier des signaux, le courant d'obscurité est 0,061 électrons par pixel par seconde, et l'efficacité quantique est supérieur à 0,90. Le système est contrôlé par le logiciel AxioVision 4.8, y compris le module SmartExperiments. Pour la détection de tdTomad', nous utilisons un jeu de filtres Zeiss 75HE pour laquelle 85% de la lumière qui passe peut exciter le fluor et 95% de la lumière émise passeront le filtre d'émission.
- Assembler un système de formation d'image avec un microscope inversé et une caméra pour la détection sensible EMCCD de signaux, une source de lumière LED pour l'excitation spécifique et rapide de coffrage, et une platine motorisée bras principale, et le contrôle de logiciels pour l'acquisition automatique d'images de plus longs intervalles de temps multiples avec z-piles. Le système doit reposer sur une table pneumatique à être isolé des vibrations.
- Monter un incubateur étape-top pour maintenir les cellules à 37 ° C, 5-10% de CO 2 dans une chambre humidifiée. Prévoyez suffisamment de temps pour que le système atteindre une température stable pour minimiser les artéfacts de mouvement pendant l'expérience.
- Utiliser un collier chauffant pour objectif d'empêcher le siphonnage objectif de la chaleur à partir de l'échantillon.
3. Visualisation de l'ADN marqué
- Cellules de la plaque de 35 mmverre à fond plat, à une densité de confluence moins de 10%, ce qui permettra aux paires de cellules à se diviser en colonies de 8-16 cellules sans chevauchement. Pour ce faire, au moins 24-48 heures avant l'imagerie de telle sorte que les cellules viables ont le temps de se diviser.
- Un à trois heures avant le début de la formation d'image, la plaque de rinçage 3 fois avec du milieu de culture dépourvu de ces deux médicaments sélectifs et IPTG. Cette procédure nettoie les cellules non viables et permet Laci protéines de fusion pour lier les sites Laco dans les plasmides.
- Remplacez le milieu de culture avec 2 ml de DMEM avec 10% de sérum de veau foetal et 25 mM d'HEPES.
- Remplacer la partie supérieure de la boîte de culture avec CultFoil étiré dans une bague de montage pour un plat de 35 mm. Cette couverture va inhiber l'évaporation du milieu de culture, ce qui augmenterait la concentration de sel dans le temps et tuer les cellules.
- Utiliser interférence contraste différentiel (DIC) d'imagerie pour visualiser les cellules et déterminer le plan focal de la partie supérieure et inférieure des cellules dans plusieurs champs de vision.Dans chaque domaine, passer à un plan focal d'environ 1/3 de la voie à partir du haut de la cellule. Enregistrer les coordonnées x, y, z dans la liste des postes de scène enregistrés.
Remarque: Les signaux plasmides peut ne pas être visible à travers les oculaires lorsque les cellules sont éclairées par des LED de la longueur d'onde appropriée pour la protéine de fusion LacI. Signaux faibles ne peuvent être visibles à l'utilisation de l'appareil photo EMCCD, ce qui permet l'intégration du signal dans le temps et donc amplifie efficacement des signaux faibles. - Dans le logiciel de commande microscope, définir une z-pile d'images devant être effectuées au niveau de chaque position de phase enregistrée. Choisissez la taille de l'étape az 0,35 à 0.50 pm, ce qui vous permettra de Nyquist d'échantillonnage approximative dans la dimension z 14. Inclure les "extra" tranches au-dessus et en dessous des plans dans lesquels se trouvent les cellules, ces tranches de permettre la détection suivre les mouvements cellulaires au cours du cycle cellulaire, et sont également utilisés dans le traitement post-acquisition (déconvolution) des piles d'images. Cette inclusion seraentraîner une pile de 40-60 images, en fonction de l'épaisseur des cellules.
- Dans le logiciel de contrôle de microscope, de définir une expérience de séries chronologiques pour recueillir une image de champ lumineux de la z-piles à intervalles de 30 min (pour le suivi des divisions cellulaires et les migrations sur de longues périodes) et des images de fluorescence à 10-60 minutes d'intervalle (pour visualiser des plasmides à l'intérieur des cellules). Ne pas utiliser l'imagerie DIC cours de l'expérience, car elle nécessite plus de lumière que l'imagerie standard du champ lumineux, ce qui peut exposer les cellules inutilement à la phototoxicité au cours de longues expériences.
- Commencez l'expérience contrôlée par logiciel. Assurez-vous que le système n'est pas perturbé (frappée, exposé à la lumière ambiante excessive, etc) pendant l'expérience.
- Le cas échéant, remplacer l'eau dans le système d'humidification lors de l'expérience.
4. Post-traitement des images d'acquisition
- Passez en revue les images pour chaque point z-pile et le temps. Rogner sur les zones inutiles d'les images afin de réduire le temps de traitement de l'ordinateur à l'étape suivante.
- Utiliser un algorithme de déconvolution pour ré-attribuer à l'intensité du signal du pixel d'origine de chaque pile 15-z. Bien que cette déconvolution peut être basée sur une fonction d'étalement du point théorique de votre système d'imagerie, il est préférable de mesurer la fonction d'étalement de point de votre système d'imagerie par microsphères fluorescentes, et d'utiliser cette mesure dans l'algorithme de déconvolution. Nous avons mesuré la fonction d'étalement de point de notre système d'imagerie et appliqué un. Limité algorithme itératif du maximum de vraisemblance dans AxioVision logiciel (description du logiciel AxioVision, Zeiss)
- Examinez les images pour suivre les changements d'intensité et les mouvements des plasmides cours du cycle cellulaire et la séparation des plasmides dans les cellules filles.
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Representative Results
Les projections d'intensité maximale de Z-piles acquises dans une expérience représentative sont présentés dans la figure 3. Typiques des signaux plasmide sont présents dans 3-8 tranches de la z-stack, selon qu'ils représentent unique ou de groupes de plasmides. Dans le cas de l'EBV et KSHV plasmides dérivés, les signaux se déplacent lentement à l'intérieur de la cellule jusqu'à ce que la pile atteint la mitose. Les cellules elles-mêmes migrent au cours de l'expérience. Ils deviennent sphériques et se détacher de la vaisselle lors de la mitose. Le cycle cellulaire des cellules HeLa et SLK en bonne santé prend environ 24 heures, les cellules de ces types qui prennent plus de 30 heures pour terminer le cycle cellulaire doit être considéré comme malsain. Les cellules filles se fixent habituellement près de l'autre et continuer à se diviser à la fois dans le cycle cellulaire suivant. Seules les cellules qui peuvent être affichées pour terminer un cycle cellulaire doit être analysé.
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Figure 1. Schéma pour faire des plasmides visible. (A) répétitions en tandem de la séquence de l'opérateur lactose (LACO) sont clonées dans le plasmide d'intérêt. La protéine répresseur lactose (LACI) se lie spécifiquement à ces séquences; fusion à une protéine fluorescente recrute l'étiquette fluorescente pour le plasmide d'intérêt. (B et C) Le noyau d'une cellule HeLa exprimant LacI-tdTomato est fluorescent en raison de la signal de localisation nucléaire de la protéine de fusion le localiser dans le noyau. Génomes codant pour des séquences KSHV Laco recruter de nombreuses copies de la protéine fluorescente et de se démarquer en tant que signaux lumineux sur l'intensité de fond du noyau en l'absence d'IPTG (B), alors que les protéines fluorescentes LacI sont empêchés de se lier à sa reconnaissance Laco séquence dans la présence d'IPTG (C). Ces images sont faites pour inclure de multiples calculs z plans dans lesquels les différents signaux résident.
Figure 2. Schéma de la procédure de visualisation plasmide. Tout d'abord, en tandem répète LACO sont clonées dans le plasmide d'intérêt. Que le plasmide est introduit dans les cellules par transfection. Des clones de cellules transfectées sont sélectionnées et tamisé, puis infectées par un rétrovirus exprimant une protéine de fusion fluorescente LacI.
Figure 3. Revoir les images pour suivre les plasmides tout au long du cycle cellulaire. Marquées par fluorescence génomes viraux dans une cellule HeLa (A) sont synthétisées dans la phase S (B) et partitionné aux cellules filles lors de la division cellulaire (CE) et peuvent être suivis pendant plusieurs générations. Indiqués sont des projections intensité maximale de z-piles acquis d'un cycle cellulaire HeLa à cinq points dans le temps dans une expérience représentative. Ces images sont faites comme dans la figure 1B et C.
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Discussion
La méthode décrite ici peut être utilisé pour suivre en direct plasmides dans les cellules de mammifères au cours du temps couvrant plusieurs générations. En limitant l'exposition à la lumière d'excitation, nous avons utilisé ces techniques pour suivre les cellules de paires nouvellement divisées par des colonies de cellules 16-32, représentant au moins 72 heures et 3 divisions cellulaires. Ces expériences fournissent des informations qui ne peuvent être obtenues à partir d'essais statiques telles que la PCR quantitative, transfert de Southern, et FISH.
Il est essentiel de dépister des clones de cellules pour les plasmides avec une structure homogène, comme les réarrangements peuvent se produire lors de l'utilisation des plasmides avec des séquences répétitives telles que les répétitions en tandem Laco. En outre, il est utile pour optimiser une infection rétrovirale et les clones de cellules infectées écran pour une intensité de signal optimale. Les cellules exprimant la protéine trop LacI aura fluorescence de fond élevé dans le noyau, et ceux qui expriment trop peu auront signaux faibles. Enfin, il is important d'examiner la morphologie des cellules et choisissez les cellules saines lors du marquage des champs de vision à utiliser lors de leur visualisation.
Cette technique peut être utilisée pour visualiser presque toute molécule d'ADN, à condition qu'il puisse être conçu pour inclure répétitions en tandem de la séquence Laco. Les exemples incluent les chromosomes cellulaires, plasmides d'origine naturelle et artificielle, et des génomes viraux emballés dans des virions. Dans des expériences similaires à celle représentée sur la figure 3, nous avons constaté que nos KSHV plasmides dérivés semblent être partitionné de façon aléatoire lors de la division cellulaire. Un prolongement logique de la technique consiste à marquer une molécule d'ADN comme une paire Laco / LacI avec une protéine fluorescente, et une autre molécule d'ADN dans la même cellule qu'un opérateur tétracycline / Tetetracycline paire Répresseur avec une autre protéine fluorescente. Des expériences sont limitées par la quantité de lumière d'excitation des cellules peut supporter avant de subir des effets cytotoxiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions du NIH et de l'ACS, y compris T32CA009135, CA133027, CA070723, CA022443 et. Le projet de loi Sugden est un professeur American Cancer Society Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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