En<em> In vivo</em> Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet
Summary
Vi præsenterer et<em> In vivo</em> Assay til at teste blodkar permeabilitet. Dette assay er baseret på intravenøs injektion af et farvestof og efterfølgende visualisering af dets diffusion ind i interstitielle rum.
Abstract
Denne metode er baseret på den intravenøse injektion af Evans Blue i mus som forsøgsdyr model. Evans blåt er et farvestof, som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er uigennemtrængelig for albumin, så Evans Blue bundne albumin rester restriktioner i blodkar. I patologiske tilstande, der fremmer forøget vaskulær permeabilitet endotelceller delvist mister den tætte kontakt og endotelet bliver permeabel for små proteiner, såsom albumin. Denne betingelse giver mulighed for ekstravasation af Evans Blue i væv. En sund endotel forhindrer ekstravasation af farvestoffet i de omkringliggende vaskulariserede væv. Organer med forøget permeabilitet vil vise signifikant forøget blåfarvning i forhold til organer med intakt endothelium. Niveauet af vaskulær permeabilitet kan bestemmes ved simpel visualisering eller ved kvantitativ måling af farvestoffet inkorporeret milligram af væv af kontrol versus forsøgsdyr / væv. To powerful aspekter af dette assay er dens enkelhed og kvantitative egenskaber. Evans Blue farvestoffet kan ekstraheres fra væv ved inkubation af en særlig mængde væv i formamid. Evans Blue absorbansmaksimum er på 620 nm og absorbansen minimum er på 740 nm. Ved anvendelse af en standardkurve for Evans Blue, kan målinger af optisk densitet omdannes til milligram farvestof fanget milligram af væv. Statistisk analyse bør anvendes til at vurdere signifikante forskelle i vaskulær permeabilitet.
Introduction
Dannelse og vedligeholdelse af selektive permeable barrierer er afgørende for korrekt orgel udvikling og resultater 1,2. Endotelceller line blodkarret lumen og danner en semipermeabel barriere, som er afgørende i den selektive transport mellem blod og det interstitielle rum af alle organer. En passende permeabilitetsbarriere opretholdes gennem stramme celle-til-celle-kryds, som er strengt kontrolleret af vækstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterede molekyler tre. Afbrydelse af den endotelcelle-barrieren kan resultere i øget permeabilitet og vaskulær lækage. Disse virkninger ses i forskellige sygdomstilstande og forståelsen af den understregningen molekylære signalering kræver tværfaglige metoder 4,5. I denne artikel beskriver vi en in vivo metode til at måle fartøj permeabilitet ved hjælp af en musemodel.
Assayet vi beskriver, også kendt som Miles-assay, er et godt established metode til at teste vaskulær permeabilitet in vivo. Assayet er baseret på det faktum, at, under basale fysiologiske betingelser, er albumin ikke krydse den endotele barriere. Evans Blue, et azofarvestof med høj affinitet for albumin, indsprøjtes i blodstrømmen i et forsøgsdyr, og under fysiologiske betingelser, forventes den at være begrænset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulus tilsættes, enten topisk eller systemisk, blodkar begynder at lække protein og dermed også Evans-blåt, der er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farvning af væv, der har permeable fartøjer.
Vellykket injektion af farvestoffet i mus laterale halevene er kritisk for godt resultat af forsøget. Haleveneinjektion teknik kræver omfattende praksis og bør beherskes før du starter eksperimentet.
Fartøjets permeabilitet er meget afhængig af alderen og vægten af enimal, så når man sammenligner forskellige musestammer er det bydende nødvendigt, at de mus eller andre forsøgspersoner har tæt på identiske fødselsdatoer og vægt. Andre faktorer, der påvirker permeabiliteten af den endotheliale barriere er miljømæssige forhold såsom temperatur, luftfugtighed, og meget vigtigt, håndtering stress på musen. På grund af de mange faktorer, der kan påvirke resultatet af forsøget er det altid tilrådeligt at eksperimentet gentages mindst tre gange og statistiske analyser udført.
Dette assay kan anvendes, eller for at sammenligne kar permeabiliteten af mus, der er blevet genetisk modificeret, samt mus med forskellige genetiske baggrunde. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær af en stimulus, afhængigt af funktionen af genet, der er moduleret. Dette assay kan også anvendes, eller til at teste virkningen af forskellige forbindelser på fartøjet permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være til stede i adskillige systemiske sygdomme, herunder diabetes, hypertension og autoimmune sygdomme 6,7,8. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være medieret af forskydningsspænding, vækstfaktorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor og fibroblastvækstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin 9. Ekstravasation af vand og små molekyle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
