<em> In vivo</em> Assay לבדיקת חדירות כלי דם
Summary
אנו מציגים<em> In vivo</em> בדיקה לבדיקת חדירות כלי דם. בדיקה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של הדמיה לצבוע ולאחר מכן של דיפוזיה שלו למרחבי ביניים.
Abstract
שיטה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בעכברים כמודל חית המבחן. אוונס הכחול הוא צבע שנקשר אלבומין. בתנאים פיסיולוגיים האנדותל בלתי חדיר לאלבומין, כך שרידי אלבומין כריכה כחולה אוונס מוגבל בתוך כלי דם. בתנאים פתולוגיים שמקדמים חדירות תאי אנדותל כלי דם מוגבר באופן חלקי לאבד הקשר הקרוב שלהם והאנדותל הופך חדיר לחלבונים קטנים כגון אלבומין. מצב זה מאפשר לextravasation של אוונס הכחול ברקמות. האנדותל בריא מונע extravasation של הצבע ברקמות כלי הדם הסמוכות. איברים עם חדירות מוגברות יציגו צבע כחול גדל באופן משמעותי בהשוואה לאיברים עם האנדותל בשלמותה. רמת חדירות כלי דם יכולה להיות מוערכת על ידי הדמיה פשוטה או על ידי מדידת כמותית של הצבע המשולבת למיליגרם של רקמה של שליטה מול חיים / רקמות ניסיוניות. שני poweהיבטי rful של assay זה הם הפשטות שלו ומאפייני כמותיים. אוונס הכחול צבע ניתן לחלץ מרקמות על ידי דוגר כמות מסוימת של רקמה בפוראמיד. מרבית הספיגה הכחולה אוונס הוא בעמ '620 ננומטר וספיגה מינימאלית היא ב740 ננומטר. באמצעות עקומת סטנדרט עבור אוונס הכחול, מדידות צפיפות אופטיות ניתן להמיר את צבע מיליגרם כבש למיליגרם של רקמה. ניתוח סטטיסטי יש להשתמש כדי להעריך הבדלים משמעותיים בחדירות כלי דם.
Introduction
גיבוש ותחזוקה של מחסומים חדירים סלקטיבית הם חיוניים להתפתחות איבר תקין ו1,2 ביצועים. תאי האנדותל קו לום כלי הדם ויוצרים מחסום חדיר למחצה כי הוא חיוני בהובלה סלקטיבית בין הדם למרחב ביניים של כל האיברים. מחסום חדירות נאותות נשמר באמצעות צומת תא לתא צפופים הנשלטים בקפידה על ידי גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות הקשורות מתח אחרות 3. שיבוש של מכשול התא האנדותל יכול לגרום לחדירות מוגברות ודליפה של כלי דם. תופעות אלו נצפות במצבי מחלה שונים וההבנה של האיתות המולקולרית הקו התחתונה דורשת שיטות רבות תחומיות 4,5. במאמר זה, אנו מתארים בשיטת vivo למדוד חדירות כולים תוך שימוש במודל עכבר.
הבדיקה שאנחנו מתארים, הידוע גם כassay מיילס, היא-establ גםished שיטה לבדיקת חדירות כלי דם בגוף חי. הבדיקה מתבססת על העובדה שבתנאים פיסיולוגיים בסיסיים, אלבומין אינו חוצה את מחסום אנדותל. אוונס הכחול, צבע אזו עם זיקה חזקה לאלבומין, מוזרק לזרם הדם של בעלי חיים הניסיונות, ובתנאים פיסיולוגיים, אך הוא צפוי להיות מוגבל בתוך כלי דם. כאשר גירוי חדירות כלי דם נוסף, או topically או מערכתי, כלי דם מתחילים לדלוף חלבון ובכך, גם הכחול אוונס שהוא חייב אלבומין. התוצאה היא גוון כחלחל מהיר של רקמות שיש להם כולים חדירים.
זריקה מוצלחת של הצבע בוריד זנב העכבר לרוחב היא קריטית לתוצאות הטובות של הניסוי. טכניקת הזרקת וריד זנב דורשת תרגול רב וצריכה להיות שולטת לפני תחילת הניסוי.
חדירות כלי תלויות מאוד בגיל ובמשקל שלimal, ולכן כאשר משווים זנים שונים של עכברים הוא הכרחי כי העכברים או נושאים אחרים יש מבחן קרוב לתאריכי לידה זהים ומשקל. גורמים אחרים המשפיעים על החדירות של מחסום אנדותל הם תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, ומאוד חשוב, מתח הטיפול בעכבר. בשל ריבוי גורמים שיכולים להשפיע על התוצאה של הניסוי זה תמיד רצוי שהניסוי חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו.
בדיקה זו יכולה לשמש או להשוואת חדירות כלי של עכברים שעברו שינוי גנטי, כמו גם עכברים עם רקע גנטי שונה. חדירות ניתן להעריך בנוכחותו או היעדריו של גירוי, בהתאם לפונקציה של הגן שהוא מווסת. assay זה יכול לשמש גם או כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות בחדירות כלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
חדירות כלי דם היא סמן קריטי למצב כלי דם. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות נוכח בכמה מחלות מערכתיות, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ומחלות אוטואימוניות 6,7,8. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות מתווכות על ידי מאמץ גזירה, גורמי גדילת כלי דם האנדותל כמו גורם גדילה ופקטור גדילה פי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
