<em> В естественных условиях</em> Анализ для тестирования проницаемости кровеносных сосудов
Summary
Мы представляем<em> В естественных условиях</em> Анализ для проверки проницаемость кровеносных сосудов. Этот анализ основан на внутривенное введение красителя и последующей визуализацией его диффузии в интерстициального пространства.
Abstract
Этот метод основан на внутривенном введении Evans Blue мышей в качестве модели испытаний на животных. Эванс синий краситель, который связывается альбумином. В физиологических условиях эндотелий является непроницаемой для альбумина, так Эванса синего связанного альбумина остается ограниченным в кровеносных сосудах. В патологических условиях, которые способствуют повышение сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток частично теряют свои тесные контакты и эндотелий становится проницаемой для небольших белков, таких как альбумин. Это условие позволяет экстравазации Evans Blue в тканях. Здоровый эндотелий предотвращает кровоизлияние красителя в соседние ткани васкуляризированной. Органы с повышенной проницаемостью покажет значительно увеличилось синюю окраску по сравнению с органов с интактным эндотелием. Уровень проницаемости сосудов можно оценить по простой визуализации или количественного измерения красителя включены на миллиграмм ткани контроля в сравнении с экспериментальными животными / ткань. Два Пауrful аспекты этого анализа являются его простота и количественных характеристик. Evans Blue красителей могут быть извлечены из тканей путем инкубации определенное количество ткани в формамида. Evans Blue максимум поглощения находится при 620 нм и поглощения минимум при 740 нм. С помощью стандартной кривой для Evans Blue, измерения оптической плотности могут быть преобразованы в миллиграммах красителя захватили на миллиграмм ткани. Статистический анализ должен быть использован для оценки существенных различий в проницаемости сосудов.
Introduction
Формирование и поддержание избирательный проницаемые барьеры, необходимые для нормального развития органов и производительностью 1,2. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и образуют полупроницаемый барьер, который играет важную роль в избирательный перевозок между кровью и интерстициальным пространством всех органов. Адекватный барьер проницаемости поддерживается благодаря тесной клетки к клетке соединений, которые строго контролируются факторы роста, цитокины и другие связанные со стрессом молекулы 3. Нарушение эндотелиального барьера клетки может привести к увеличению проницаемости сосудистой и утечки. Эти эффекты проявляются в различных болезненных состояний и понимание подчеркивание молекулярного сигнального требует междисциплинарных методов 4,5. В этой статье мы опишем в естественных условиях метод измерения проницаемости судна с помощью мыши модели.
Анализ, который мы описываем, также известный как анализ Майлз, это хорошо establбедных и обнищавших слоев метод для тестирования проницаемости сосудов в естественных условиях. Анализ основан на том факте, что при физиологических условиях базальная, альбумин не пересекает эндотелиального барьера. Evans Blue, азокрасителя с высоким сродством к альбумина, вводится в кровоток подопытных животных, и в физиологических условиях, как ожидается, будет ограничен в пределах кровеносных сосудов. При сосудистой проницаемости стимул добавляется, либо местно или системно, кровеносные сосуды начинают течь белка и, таким образом, также синего Эванса, который связан с альбумином. Это приводит к быстрому голубовато окраска тканей, которые имеют проницаемые сосуды.
Успешное введение красителя в мышь латеральную хвостовую вену имеет решающее значение для хорошего результата эксперимента. Хвостовую вену инъекцию техника требует обширной практики и должны быть освоены до начала эксперимента.
Судно проницаемость сильно зависит от возраста и весамальных, так что при сравнении различных линий мышей важно, что у мышей или других испытуемых имеют близкие к идентичным даты рождения и весом. Другие факторы, которые влияют на проницаемость эндотелиального барьера условий окружающей среды, таких как температура, влажность, и очень важно, обработка стресс мыши. В связи с множеством факторов, которые могут повлиять на результаты эксперимента это всегда желательно, что эксперимент повторяется не менее трех раз и статистический анализ выполняется.
Этот анализ может быть использован либо для сравнения судна проницаемость мышей, которые были генетически модифицированы, а также мышей с различным генетическим фоном. Проницаемость может быть оценена в присутствии или в отсутствии стимула, в зависимости от функции генов, которые модулируют. Этот анализ также может быть использован и для проверки влияния различных соединений на судне проницаемость.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проницаемости сосудов является важным маркером для крови статуса судна. Повышенная проницаемость сосудов, как было показано присутствовать в нескольких системных заболеваний, включая диабет, гипертонию и аутоиммунных заболеваний 6,7,8. Повышенная проницаемость сосудов была пок?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
