アン<em生体内で></em血管透過性をテストする>アッセイ
Summary
我々は提示している<em生体内で></em>血管透過性をテストするためのアッセイ。このアッセイは、間質空間への拡散の染料およびその後可視化の静脈注射に基づいています。
Abstract
このメソッドは、テストモデル動物としてマウスでのエバンスブルーの静脈注射に基づいています。エバンスブルーはアルブミンと結合する色素である。生理的条件下では内皮細胞は血管内に限定アルブミンので、エバンスブルーアルブミン結合した遺骨に対して不透過性である。増加した血管透過性内皮細胞を促進する病態では部分的にそれらの密接な接触を失い、内皮は、アルブミンのような小さなタンパク質に透過性になる。この条件は、組織中のエバンスブルーの漏出を可能にします。健康な内皮細胞は、隣接する血管化組織における色素の漏出を防ぐことができます。透過性の増大を持つ器官が無傷の内皮細胞と器官に比べて大幅に増加した青色呈色が表示されます。血管透過性のレベルは、単純な可視化によって、または実験動物/組織vsコントロールの組織のミリグラムあたり組み込ま色素を定量的に測定することによって評価することができる。二つポウこのアッセイのrful側面は、そのシンプルさと定量的な特性です。エバンスブルー色素をホルムアミドの組織の具体的な金額をインキュベートすることにより、組織から抽出することができます。 620 nmの吸光度の最小値である最大のエバンスブルーの吸光度は740 nmである。エバンスブルーの標準曲線を用いることで、光学濃度の測定は、組織のミリグラム当たりミリグラム捕捉色素に変換することができます。統計解析は、血管透過性の有意差を評価するために使用されるべきである。
Introduction
選択透過性障壁の形成と維持には、適切な臓器の開発と性能1,2のために不可欠です。内皮細胞ライン血管内腔と血液とすべての器官の間質空間との間の選択的輸送に不可欠である半透過性の障壁を形成する。十分な透過障壁は固く成長因子、サイトカインやその他のストレス関連分子3によって制御されているタイトな細胞から細胞への結合を介して維持されています。内皮細胞障壁の破壊は透過性の増大と血管漏出をもたらすことができます。これらの効果は、様々な疾患状態で見られると下線分子シグナルの理解が学際的方法は4,5が必要とされます。この記事では、我々はマウスモデルを用いて血管の透過性を測定するin vivo法について説明します。
またマイルスアッセイとして知られている我々が説明している検定は、よくestablですin vivoで血管透過性をテストするためのメソッドをished。アッセイは、基底の生理的条件下で、アルブミンは、内皮関門を通過しない、という事実に基づいている。エバンスブルー、アルブミンに対して高い親和性を有するアゾ色素は、実験動物の血流中に注入され、生理的条件下では、血管内に制限されることが期待されています。血管透過性の刺激が加えられると、どちら局所的または全身的に血管がアルブミンに結合しているエバンスブルーはまた、このようにタンパク質をリークし始めると。血管透過性を持っている組織の急速な青みがかった色でこの結果。
マウス外側尾静脈に色素の注射は成功した実験の良い結果のために重要である。尾静脈注射技術は広範囲の練習を必要とし、実験を開始する前に習得しなければならない。
血管の透過性は、年齢や体重に大きく依存しているimalので、異なるマウス系統を比較するときには、マウスまたは他の被験者が同じ誕生日と体重の近くに持っていることが不可欠です。内皮関門の透過性に影響を与えるその他の要素には、温度、湿度などの環境条件であり、非常に重要なのは、マウスのハンドリングストレス。それは実験を少なくとも3回実行される統計解析が繰り返されることを常に推奨されている実験の結果に影響を与えることができ、多数の要因に起因する。
このアッセイは、血管遺伝的に改変されたマウスの透過性だけでなく、さまざまな遺伝的背景を持つマウスを比較したり、使用することができます。透磁率が変調されている遺伝子の機能に応じて、刺激の有無で評価することができる。このアッセイは、血管透過性の異なる化合物の効果をテストするために使用したりすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管透過性は、血管の状態のための重要なマーカーである。増加した血管透過性は、糖尿病、高血圧症、自己免疫疾患6,7,8を含むいくつかの全身性疾患、に存在することが示されている。増加した血管透過性がせん断応力によって媒介されることが示されており、血管内皮細胞増殖因子と線維芽細胞増殖因子、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン9のような炎症性メディエ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国国立衛生研究所、R01CA142928からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
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