Un<em> In vivo</em> Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue
Summary
Stiamo presentando un<em> In vivo</em> Saggio per testare vaso sanguigno permeabilità. Questo saggio è basato sulla iniezione endovenosa di un colorante e la successiva visualizzazione della sua diffusione negli spazi interstiziali.
Abstract
Questo metodo si basa sulla iniezione endovenosa di Evans blu in topi come modello animale di prova. Blu di Evans è un colorante che si lega all'albumina. In condizioni fisiologiche l'endotelio è impermeabile all'albumina, in modo da Evans blu resti albumina legata restrizioni all'interno dei vasi sanguigni. In condizioni patologiche che promuovere un aumento della permeabilità delle cellule endoteliali vascolari parzialmente perdono i loro contatti stretti e l'endotelio diventa permeabile alle proteine di piccole dimensioni come l'albumina. Questa condizione consente per lo stravaso di Blu di Evans nei tessuti. Un endotelio sano impedisce stravaso del colorante nei tessuti circostanti vascolarizzati. Organi con aumento della permeabilità mostrerà significativamente aumentata colorazione blu rispetto a organi con endotelio intatto. Il livello di permeabilità vascolare può essere valutata mediante semplice visualizzazione o misurazione quantitativa del colorante incorporato per milligrammo di tessuto di controllo contro animale sperimentale / tessuto. Due PoweRFUL aspetti di questo test è la sua semplicità e le caratteristiche quantitative. Evans blu colorante può essere estratto dai tessuti incubando una quantità specifica di tessuto in formammide. Evans Blue è massima assorbanza a 620 nm e minimo assorbimento è a 740 nm. Utilizzando una curva standard per Evans blu, misure di densità ottica può essere convertito in colorante milligrammo catturato per milligrammo di tessuto. Analisi statistica dovrebbe essere utilizzato per valutare le differenze significative nella permeabilità vascolare.
Introduction
Formazione e il mantenimento di barriere permeabili selettive sono essenziali per lo sviluppo di organi corretto e 1,2 prestazioni. Cellule endoteliali linea lume del vaso sanguigno e formano una barriera semipermeabile che è essenziale per il trasporto selettivo tra sangue e lo spazio interstiziale di tutti gli organi. Una barriera di permeabilità adeguata è mantenuta attraverso stretti cellula-cellula giunzioni che sono strettamente controllate da fattori di crescita, citochine e molecole correlate allo stress altri 3. Deterioramento della barriera endoteliale può causare aumentata permeabilità vascolare e perdite. Questi effetti sono visti in diversi stati patologici e la comprensione della segnalazione sottolineatura molecolare richiede metodi multidisciplinari 4,5. In questo articolo, si descrive un metodo in vivo per misurare la permeabilità nave che utilizza un modello di topo.
Il saggio stiamo descrivendo, anche noto come saggio Miles, è una ben establmentata metodo per testare la permeabilità vascolare in vivo. Il saggio è basato sul fatto che, in condizioni fisiologiche basali, albumina non attraversa la barriera endoteliale. Evans blu, un colorante azoico con alta affinità per l'albumina, viene iniettato nel flusso sanguigno di un animale sperimentale, e in condizioni fisiologiche, esso dovrebbe essere limitato entro vasi sanguigni. Quando uno stimolo permeabilità vascolare è aggiunto, sia a livello topico o per via sistemica, i vasi sanguigni iniziano a perdere proteine e, quindi, anche il blu Evans che è legato all'albumina. Ciò provoca una colorazione bluastra rapida dei tessuti che hanno vasi permeabili.
Iniezione di successo del colorante nella vena laterale della coda del mouse è fondamentale per il buon esito dell'esperimento. Vena tecnica Tail iniezione richiede pratica estesa e deve essere masterizzato prima di iniziare l'esperimento.
Permeabilità vasale è fortemente dipendente dall'età e dal peso del l'IMAL, così quando si confrontano diversi ceppi di topi è imperativo che i topi o dei soggetti di prova diversi da avere vicino date di nascita e peso identici. Altri fattori che influenzano la permeabilità della barriera endoteliale sono condizioni ambientali come temperatura, umidità, e molto importante, lo stress manipolazione del mouse. A causa del gran numero di fattori che possono influenzare l'esito dell'esperimento è sempre consigliabile che l'esperimento viene ripetuto almeno tre volte e analisi statistica effettuata.
Questo test può essere utilizzato o per confrontare permeabilità vasale di topi che sono stati geneticamente modificati, nonché topi con differenti background genetico. Permeabilità può essere valutata in presenza o assenza di uno stimolo, a seconda della funzione del gene che è modulato. Questo dosaggio può anche essere utilizzato o per testare l'effetto di composti differenti permeabilità vasale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Permeabilità vascolare è un indicatore fondamentale per lo stato dei vasi sanguigni. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere presente in numerose malattie sistemiche, compreso il diabete, ipertensione e malattie autoimmuni 6,7,8. Aumento della permeabilità vascolare ha dimostrato di essere mediata da shear stress, fattori di crescita come il fattore di crescita vascolare endoteliale e fattore di crescita dei fibroblasti, mediatori infiammatori quali serotonina, istamina e bradichinina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
References
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