Summary
Nous rapportons une méthode pour isoler les cellules naïves multipotentes précurseurs dérivés de la peau (SKP) à partir de cultures de fibroblastes humains primaires. Nous montrons que ces SKPs issus de cultures de fibroblastes partagent des propriétés semblables des cellules souches à celles provenant directement de biopsies de peau humaine. Ces cellules expriment le marqueur de la crête neurale, nestine, en plus des marqueurs tels que OCT4 multipotentes et Nanog.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, plusieurs populations de cellules souches adultes ont été identifiés dans la peau humaine 1-4. L'isolement des précurseurs dermiques adultes multipotentes a d'abord été rapporté par Miller F. D laboratoire 5, 6. Ces premières études ont décrit une population de cellules précurseurs pluripotentes à partir de derme des mammifères adultes 5. Ces cellules - SKP appelés, pour les précurseurs dérivés de la peau - ont été isolés et sont passées de rongeurs et de la peau humaine et différenciées en neurones et deux descendants du mésoderme, y compris les types de cellules jamais trouvés dans la peau, comme les neurones 5. Des études immunocytochimiques sur SKPs culture ont révélé que les cellules expriment la vimentine et la nestine, une protéine de filament intermédiaire exprimé des précurseurs neuronaux et musculaires squelettiques, en plus de la fibronectine et des marqueurs de cellules souches multipotentes 6. Jusqu'à présent, les cellules souches SKPs la population adulte ont été isolés à partir de biopsies de peau de mammifère fraîchement récoltées.
ve_content "> Récemment, nous avons mis en place et a indiqué que la population de la peau des cellules précurseurs dérivées pourrait rester présente dans des cultures de fibroblastes primaires établies à partir de biopsies de la peau 7. L'hypothèse selon laquelle un petit nombre de cellules souches somatiques pourraient résider dans des cultures de fibroblastes primaires de doublements de population au début était basées sur les observations suivantes: (1) SKPs et les cultures de fibroblastes primaires proviennent du derme, et donc un petit nombre de cellules SKP pourraient rester présente dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires et (2) des cultures de fibroblastes primaires cultivées à partir de portions congelées qui ont été soumis à une température défavorable pendant le stockage ou le transfert contenait un petit nombre de cellules qui sont restées viables 7. Ces cellules rares étaient capables de développer et pourrait être repiquées plusieurs fois. Cette observation suggère qu'un petit nombre de cellules avec une puissance de prolifération élevé et la résistance au stress étaient présents dans les cultures de fibroblastes humains 7.Nous avons profité de ces résultats pour établir un protocole pour l'isolement rapide des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes primaires qui sont facilement disponibles à partir de banques de tissus à travers le monde (Figure 1). Cette méthode a une signification importante car elle permet d'isoler des cellules précurseurs lorsque des échantillons de peau ne sont pas accessibles alors que les cultures de fibroblastes peuvent être disponibles à partir de banques de tissus, ainsi, ouvrir de nouvelles opportunités pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les maladies génétiques rares ainsi que les maladies de modélisation dans un Antenne.
Protocol
1. Isolation SKP partir des cultures de fibroblastes primaires
- des cultures de fibroblastes ou l'autre des banques de cellules ou directement obtenu à partir de biopsies de peau sont maintenues en culture en croissance des fibroblastes du milieu DMEM contenant 15% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 10 mg / ml de pénicilline et 10 mg / ml de streptomycine.
Fibroblastes humains GMO3349C et GMO8398A ont été obtenus à partir de l'Institut Coriell pour la recherche médicale (Camden, New Jersey) et ont été utilisés dans cette étude.
- Cultures de doublements de population (PPD) 20 à 35 ont été utilisés pour les cultures SKP à une confluence de 80%. Une boîte de 10 cm de culture tissulaire (BD Falcon) contient environ 1,5.10 6 cellules.
- Laver les cellules avec du PBS et incuber avec 2 ml de solution de trypsine (0,25%, Invitrogen) pendant 1 heure à 37 ° C.
- Recueillir les cellules à partir de la plaque avec 5 ml de PBS et transférer la suspension de cellules dans un tube Falcon de 15 ml.
- Incuber les cellules à 4 ° C pendant 24 heures.
- Préparer le milieu de croissance SKP composé de DMEM-F12, 3:1 (V / V) et 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml d'EGF (BD Biosciences), B27 sérique supplément gratuit de 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) et 25 um / ml gentamicine (Invitrogen).
- Pellet les cellules à 1200 rpm pendant 5 min et remettre le culot cellulaire directement dans le milieu de croissance SKP 4 ml. Transférer la suspension cellulaire à un cm2 flacon de culture de tissus 25 (BD Falcon).
- Incuber le ballon à 37 ° C et à surveiller la culture pour la formation de la sphère par jour pendant 3 à 4 semaines.
2. Sphère Conditions de culture
- les cellules de la culture dans un flacon de 25 cm2 (BD Falcon) à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Agiter le flacon vigoureusement tous les jours pour éviter les cellules d'adhérer au fond du flacon. Si nécessaire, une pipette de haut en bas avec un 2 ml pipette stérile pour détacher les cellules adhérentes et transférer la culture dans un nouveau flacon.
- Premières sphères commencent à construire dans les 3 to 4 jours.
- Soit sphères sédiment au fond du flacon et le changement de la moitié du milieu tous les 3 jours. Pour conserver la même concentration finale de facteurs de croissance les facteurs de croissance ajouter 2X au milieu de croissance de SKP fraîchement préparée.
- Maintenez le volume constant maximum de 4 ml.
- Quand sphères atteignent une taille d'environ 200 mm, ils doivent être repiquées en brisant les sphères de petite taille par vigoureuse pipetage de haut en bas avec une pipette de 2 ml.
- La culture est divisé en deux flacons de 25 cm2 (BD Falcon) et des sphères cultures sont alimentation comme décrit dans l'étape 2.4).
- Sphères sont collectées pour des marqueurs de cellules souches dépistage par jour 16 à 21.
La procédure de 2.6) et 2.7) décrivent la propagation des sphères à (1) permet de nutriments et de facteurs de croissance dans du milieu compris SKP d'accéder à toutes les cellules au sein de chaque sphère et (2) pour développer la culture de la sphère SKP avant utilisation.
Typiquement cultures Sphère sous nos cuconditions de LTURE maintenir la capacité de croissance sur une période de trois mois et sont repiquées entre 3 à 4 fois.
3. Immunocytochemistry de cellules souches Marqueurs
- cultures de Sphère sont récoltées dans du PBS par jour 16 à 21. Les cultures sont culottés à 1000 rpm pendant 5 min.
- Sphères sont remises en suspension dans un petit volume de PBS.
- Dessinez deux cercles avec un stylo DAKO d'environ 0,5 m de diamètre sur des lames de microscope (marque Fisher).
- Ajouter 50 ul de suspension de la sphère dans les cercles.
- Voir par microscopie optique la présence de sphères dans chaque goutte.
- Que les gouttes sec sous le capot.
- Soit geler les diapositives à -80 ° C ou procéder avec le protocole de coloration par immunofluorescence.
- Par immunofluorescence, fixer les lames avec du méthanol pré-refroidi (100%) à -20 ° C pendant 10 min.
- Laver les lames avec PBS.
- Bloquer les diapositives avec PBS/10% de sérum de veau fœtal / 0,02% de Triton X100pendant au moins 1 heure.
- Incuber avec l'anticorps primaire (par exemple, anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, les anticorps anti-Nanog, tableau 3) dilué dans du tampon de blocage: PBS/10% de FBS pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Laver 3 fois avec le tampon de blocage et incuber avec l'anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante.
- Laver 3 fois avec le tampon de blocage et 3 fois avec PBS.
- Montage diapositives avec montage moyen Vectashield (Vector Inc.).
- Analyser des échantillons pour l'expression de marqueurs de cellules souches par immunofluorescence.
4. Analyse PCR en temps réel des niveaux d'expression de marqueurs de cellules souches
- Prenez environ 2-3 cultures Sphère ml de jour de 18 à 21.
- Pellet les sphères à 1200 rpm pendant 5 min et aspirer tout moyen.
- Isoler l'ARN à partir de sphères en utilisant le Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
- Évaluer l'ARN pureté par spectrométrie et gel d'agarose. </ Li>
- Synthétiser l'ADNc (Omniscript de la transcriptase inverse (Qiagen)) en utilisant l'ARN cellulaire total comme matrice.
- Valider les marqueurs de cellules souches par Realtime-PCR utilisant des amorces pour les marqueurs des cellules souches (voir tableau 1) en une puissance SYBR Green Mastermix PCR (Applied Biosystems) avec une concentration de 375 nM de chaque amorce et 50 ng de matrice dans un 20 pi volume de réaction. GAPDH est utilisé comme contrôle endogène.
- Pour l'amplification utilise une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 2,5 min suivie de 40 cycles à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 20 s.
- Analyser la course avec les 2 (ΔΔCt) méthode 8.
5. Différenciation Réalisé dans les cellules musculaires lisses
- Sphères du jour 21 à 26 ont été étalées en 6 boîtes de culture puits (BD Falcon) en milieu SKP.
- Les cellules ont été autorisés à adhérer et à dépasser des sphères en milieu SKP pendant 72 heures.
- Les cellules musculaires lisses (CML) differentiation commencé initiée par remplacé le milieu par un milieu de différenciation SMC consistant en haut glucose milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Invitrogen) contenant 5% de SVF, de 5 ng / ml de PDGF-BB (Invitrogen), et de 2,5 ng / ml de TGF-b1 (Invitrogen) .
- Le milieu a été changé tous les 3 jours avec un milieu de différenciation SMC fraîchement préparé pour une période de 3 à 4 semaines dans les cultures.
- Dépistage des marqueurs SMC a été réalisée après 3 à 4 semaines par immunohistochimie.
- Les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min.
- Les cellules ont été perméabilisées avec du PBS contenant 0,3% de Triton X-100 pendant 30 min.
- Les cellules ont été incubées avec des anticorps contre αSMA (MO851, Dako, 1:100), ou calponine (M3556, Dako, 1:100) pendant 1 heure à température ambiante et traité comme décrit dans 3.12) à 3.15).
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Representative Results
Nous montrons qu'une population de cellules qui augmentent de manière sélective pour générer des sphères SKP sous condition d'une croissance maîtrisée, comprenant des EGF et FGF2 sont présents dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires (Figure 1) Comme nous l'indiquions récemment 7.
des cultures de fibroblastes de PPD 15 à 25, qui correspondent généralement aux souches de fibroblastes primaires disponibles à partir de banques de cellules ont été utilisés dans cette étude. des cultures de fibroblastes soumis à la double traitement consistant en un traitement à basse température avec l'épuisement des nutriments pendant 24 heures décrite dans cette méthode reproductible cultures produites contenant des sphères flottantes (aussi appelée EB corps embryoïde) partageant des caractéristiques de croissance similaires à celle décrite précédemment pour SKPs provenant directement à partir d'échantillons de peau 7, 9.
Ici, nous montrons que l'utilisation de la méthode que nous avons récemment signalé 7, nous isolons une population de CELLS à partir de cultures de fibroblastes primaires qui présentent des propriétés similaires à celles des cellules souches neurales / précurseurs multipotentes, isolés et identifiés dans le derme humain et la souris en utilisant des conditions de culture de neurosphères 5, 10, 11. Ces SKP-dérivé de cultures de fibroblastes humains primaires montrent auto-renouvellement puissance, car ils peuvent être étendus et repiquées pendant au moins une période de trois mois in vitro (s'il vous plaît se référer à l'article de la méthode). Quand sphères ont atteint une taille de 150 à 200 m de diamètre au bout de 18 à 21 jours de culture, ils ont été brisées mécaniquement vers le bas dans une moyenne de 50 m de diamètre et a permis de re-développer en culture en suspension en milieu SKP. Ces sphères décomposées ont été autorisés à se développer jusqu'à ce qu'ils atteignent 200 uM avant d'être repiquées comme décrit dans la section Méthode. Sphères SKP peuvent être repiquées au moins trois fois. Cette observation indique que les cellules dans les sphères étaient capables de s'auto renouveler et d'élargir dans des conditions de culture Neurosphère comme outres et nous avons rapporté 5, 7.
De plus, ces cellules SKP dérivées de cultures de fibroblastes ont exprimé crête neurale et neurone nestine marqueur de cellule souche ainsi que les cellules souches embryonnaires facteurs de transcription Nanog et Oct4 et le marqueur de surface de cellule pluripotente TG30 (figure 2), de manière similaire à la SKP provenant directement de la peau biopsies 5, 7, 10. Immunohistochimie sur des sphères SKP indiqué signal positif nestine dans le cytoplasme, le 4 oct. présenté un signal nucléaire ponctué et Nanog a montré un signal nucléaire plus diffus (figure 2). En outre, le marqueur de pluripotentes humaines cellules souches embryonnaires TG30 de surface cellulaire a donné une coloration de la membrane cytoplasmique positif sur les préparatifs de la sphère SKP (Figure 2). Utilisation de PCR en temps réel, nous avons également confirmé la présence d'ARNm codant pour la nestine et Oct4 en préparation d'ARN isolé à partir de sphères SKP recueillis par jour 18 de la culture (figure 3 5,10. Pour tester davantage la multipotence du SKP provenant de cultures de fibroblastes, nous avons provoqué ces cellules à se différencier en cellules musculaires lisses (figure 4). Après 3 semaines induction dans un milieu contenant des facteurs de croissance PDGF-BB et TGF-b1 12, immunocytochimie a confirmé l'expression des marqueurs SMC, αSMA, calponine dans les CML provenant de ces SKP (Figure 4).
Collectivement, cette méthode et les résultats démontrent que les sphères SKP isolés à partir de cultures de fibroblastes primaires partagent des propriétés semblables à celles dérivées de biopsies de la peau et doivent provenir d'une population de cellules souches adultes résidant dans le derme de la peau humaine.
| Nom | Entrez ID | séquence de l'amorce | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 pb |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 pb |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 pb |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tableau 1. Liste des amorces utilisées pour la PCR en temps réel et qPCR.
| Anticorps | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 d'âne anti-IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 d'âne anti-souris IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 d'âne anti-souris IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 d'âne anti-IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tableau 3. Liste d'origine des anticorps.
Figure 1. Isolement de SKPs de cultures de fibroblastes primaires. Méthode pour SKP culture de la sphère à partir de cultures de fibroblastes dermiques primaires GMO3349C au passage 12 est décrite. Jour 0 montre la suspension de fibroblastes de départ dans un milieu de croissance SKP. Jour 4 montre la formation de la sphère visible. Jour 17 montre une sphère typique de SKP 3D. Barre d'échelle: 50 mm et de 100 um comme indiqué.arge.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 2. Immunofluorescence des sphères SKP issus de cultures de fibroblastes primaires. D'analyse d'immunofluorescence réalisée sur SKPs issus de cultures de fibroblastes primaires humains (GMO3349C). Sphère du jour 16 ont été déposés sur des lames de microscope et coloré avec anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 et anti-Nanog comme indiqué. Les noyaux ont été contre-colorées avec une tache d'ADN dapi (bleu). Barre d'échelle:. 20 mm Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Cellules dérivées du muscle lisse des sphères SKP isolés à partir de cultures de fibroblastes primaires. SKP-sphères issus de fibroblastes primaires ont été adressées à se différencier en cellules musculaires lisses (CML). (A) l'imagerie par contraste de phase récapitulant les différentes étapes de la culture de la culture de la sphère SKP à la différenciation SMC (panneau supérieur). (B) CML provenant de sphères SKP ont été immunocolorées des marqueurs SMC indiqués, α-Smooth muscle actine (αSMA) et calponine comme indiqué. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
En utilisant la méthode décrite ici, les cellules souches dermiques naïfs peuvent être isolés à partir de cultures de fibroblastes dermiques primaires. Grâce à cette approche, nous avons récemment signalé l'isolement et la caractérisation des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes provenant de patients atteints d'un syndrome génétique rare, Hutchinson-Gilford progeria syndrome 7. Comme le montrent ici les cellules marqueurs de cellules souches expriment précurseurs sont capables d'auto-renouvellement et peuvent être dirigées à se différencier en différentes lignées cellulaires, y compris des fibroblastes et des cellules musculaires lisses (s'il vous plaît se référer à la Figure 4 par Wenzel et al., 2012) 7. Cette méthode offre plusieurs avantages à la méthode précédemment rapporté pour l'isolement de SKPs à partir d'échantillons de mammifères de la peau 10. SKP peut être isolé à partir de cultures de fibroblastes primaires qui sont soit fraîchement établies à partir de biopsies de peau ou à partir de cultures de fibroblastes primaires qui existent déjà et peut être obtenuà partir de banques de cellules à travers le monde. Cette nouvelle approche offre la possibilité d'étudier l'implication de cellules souches adultes dans la pathogenèse de diverses maladies génétiques rares et pour lesquels des échantillons de peau ne sont pas facilement disponibles. Enfin, cette méthode offre une fenêtre d'opportunité pour explorer la biologie des cellules souches adultes et de disséquer leur impact au cours de l'état physiologique et la maladie. En conclusion, cette approche offre un moyen nouveau et rapide pour isoler les cellules précurseurs dérivées de la peau.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation Alexander von Humboldt (5090371), le Centre Kühne Christine de recherche sur les allergies et l'éducation (CK-CARE), et le Bayerischen Staatsministerium (pour KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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