Summary
Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.
Abstract
Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben mehrere erwachsenen Stammzell-Populationen in der menschlichen Haut 1-4 identifiziert worden. Die Isolierung von multipotent erwachsenen Haut Vorstufen wurde zuerst von F. Miller D Labor 5, 6 gemeldet. Diese frühen Studien beschrieben eine multipotent Vorläufer-Zell-Population von adulten Dermis 5. Diese Zellen - bezeichnet SKPs, für Haut-abgeleiteten Vorstufen - wurden isoliert und expandiert von Nagetier-und menschlichen Haut und differenziert sowohl in neuralen und mesodermalen Nachkommen, darunter Zelltypen nie in der Haut gefunden, wie Neuronen 5. Immunzytochemische Studien an kultivierten Zellen SKPs ergab, dass Vimentin und Nestin, ein Intermediärfilament Protein in neuronalen und Skelettmuskel Vorstufen ausgedrückt ausgedrückt zusätzlich zu Fibronektin und multipotent Stammzellmarkern 6. Bis jetzt haben die adulten Stammzellen Bevölkerung SKPs aus frisch gesammelten Säugerhaut Biopsien isoliert worden.
ve_content "> Vor kurzem haben wir festgestellt, und berichtete, dass eine Population von Haut abgeleitet Vorläuferzellen bleiben konnte in primären Fibroblasten Kulturen aus Hautbiopsien 7 etabliert. Die Annahme, dass ein paar somatischen Stammzellen könnten in primären Fibroblastenkulturen am frühen Populationsverdopplungen aufzuhalten war basierend auf den folgenden Beobachtungen: (1) SKPs und primären Fibroblasten Kulturen werden von der Dermis abgeleitet und damit eine kleine Anzahl von SKP Zellen bleiben konnte in primären dermalen Fibroblasten Kulturen und (2) der primären Fibroblastenkulturen aus gefrorenen Aliquots, die angebaut wurden unterzogen, um ungünstige bei Lagerung oder Übertragung enthielt eine geringe Anzahl von Zellen, lebensfähige 7 blieb. Diese seltenen Zellen waren in der Lage zu erweitern und können passagiert werden mehrmals. Diese Beobachtung vorgeschlagen, dass eine kleine Anzahl von Zellen mit hoher Verbreitung Wirksamkeit und Widerstandsfähigkeit gegen Stress waren im menschlichen Fibroblastenkulturen 7.Wir nutzten diese Erkenntnisse, um ein Protokoll für die schnelle Isolierung von adulten Stammzellen aus primären Fibroblasten Kulturen, die leicht zugänglich von Gewebe Banken auf der ganzen Welt (Abbildung 1) zu etablieren. Diese Methode hat wichtige Bedeutung, da sie die Isolierung von Vorläuferzellen ermöglicht, wenn Hautproben nicht zugänglich sind, während Fibroblastenkulturen kann aus Gewebe Banken zur Verfügung, damit die Eröffnung neuer Möglichkeiten, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen seltene genetische Erkrankungen sowie Erkrankungen Modellierung in eine sezieren Gericht.
Protocol
1. SKP Isolation von Primär Fibroblastenkulturen
- Fibroblasten-Kulturen entweder aus Zellbanken oder direkt aus Hautproben sind in Kultur in Fibroblastenwachstumsfaktor DMEM mit 15% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 10 mg / ml Penicillin und 10 mg / ml Streptomycin gehalten.
Humane Fibroblasten GMO3349C und GMO8398A wurden aus dem Coriell Institut für medizinische Forschung (Camden, NJ) erhalten und wurden in dieser Studie verwendet.
- Kulturen von Populationsverdopplungen (PPD) 20 bis 35 wurden für SKP Kulturen bei einer Konfluenz von 80% verwendet. Eine 10 cm Gewebekulturschale (BD Falcon) enthält etwa 1.5x10 6 Zellen.
- Waschen der Zellen mit PBS und Inkubation mit 2 ml Trypsin-Lösung (0,25%, Invitrogen) für 1 Stunde bei 37 ° C.
- Sammeln Zellen von der Platte mit 5 ml PBS und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon-Röhrchen.
- Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 24 Stunden.
- Bereiten SKP Nährmedium bestehend aus DMEM-F12, 3:1 (V / V) und 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 Serum kostenlose Beilage 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) und 25 um / ml Gentamycin (Invitrogen).
- Pellet die Zellen bei 1.200 rpm für 5 min und Zellpellet direkt in 4 ml Wachstumsmedium SKP. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 25 cm 2 Zellkulturflasche (BD Falcon).
- Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C und überwachen die Kultur für Bildung Sphäre täglich für 3 bis 4 Wochen.
2. Sphere Kultur AGB
- Kultur Zellen in einem 25 cm 2-Flasche (BD Falcon) bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Schütteln Sie die Flasche kräftig täglich um Zellen zu vermeiden, um den Boden des Kolbens haften. Falls erforderlich, und Abpipettieren mit 2 ml sterilen Pipette zu adhärenten Zellen trennen und zu übertragen, die Kultur zu einem neuen Kolben.
- Erste Kugeln anfangen zu bauen innerhalb von 3 to 4 days.
- Lassen Sphären Sediment am Boden des Kolbens und Wandel Hälfte des Mediums alle 3 Tage. Um die gleiche Endkonzentration von Wachstumsfaktoren-Add 2X Wachstumsfaktoren auf die frisch zubereiteten SKP Nährmedium.
- Halten Sie die Lautstärke konstant maximal 4 ml.
- Wenn Kugeln eine Größe von ~ 200 mm erreichen sie sollten durch den Abbau der Sphären zu kleineren durch kräftiges Auf-und Abpipettieren mit einer 2 ml Pipette passagiert werden.
- Die Kultur wird in zwei 25 cm 2-Kolben (BD Falcon) und Kugeln Kulturen aufgeteilt sind Futtermittel im Sinne von Schritt 2.4) beschrieben.
- Kugeln sind für Stammzell-Marker Screening von Tag 16 bis 21 gesammelt.
Das Verfahren von 2.6) und 2.7) beschreiben die Ausbreitung der Kugeln (1) können Nährstoffe und Wachstumsfaktoren in SKP Medium enthalten, um alle Zellen in jedem Bereich zuzugreifen und (2), um die Kugel SKP Kultur vor Gebrauch erweitern.
Typischerweise Sphere Kulturen unter unserer culture Bedingungen halten die Fähigkeit zu wachsen über einen Zeitraum von drei Monaten und sind zwischen 3 bis 4 mal passagiert.
3. Immunocytochemistry für Stammzell-Marker
- Sphere Kulturen werden in PBS für Tag 16 bis 21 geerntet. Die Kulturen werden bei 1000 Upm für 5 Minuten pelletiert.
- Kugeln sind in einem kleinen Volumen von PBS resuspendiert.
- Zeichnen Sie zwei Kreise mit einem DAKO pen von etwa 0,5 &mgr; m im Durchmesser auf Objektträgern (Fisher-Marke).
- In 50 ul Kugel Suspension in den Kreisen.
- Überprüfen mittels Lichtmikroskopie auf das Vorhandensein von Kugeln in jedem Tropfen.
- Lassen Sie die Tropfen trocken unter der Haube.
- Entweder frieren die Objektträger bei -80 ° C oder fahren Sie mit der Immunfluoreszenz Färbeprotokoll.
- Für Immunofluoreszenzfärbung, beheben Sie die Folien mit vorgekühlten Methanol (100%) bei -20 ° C für 10 min.
- Waschen Sie die Objektträger mit PBS.
- Blockieren Sie die Folien mit PBS/10% fötalem Rinderserum / 0,02% Triton X100für mindestens 1 Stunde.
- Inkubieren mit primärem Antikörper (zB Anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Antikörper Nanog, Tabelle 3) in Blocking-Puffer verdünnt PBS/10% FBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- 3 x waschen mit Blocking-Puffer und Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Std. bei Raumtemperatur.
- 3 x waschen mit Blocking-Puffer und 3-mal mit PBS.
- Berg Dias mit Vectashield Montage Medium (Vector Inc.).
- Analysieren Sie die Proben für die Expression von Stammzell-Marker durch Immunfluoreszenzmikroskopie.
4. Realtime PCR-Analyse der Expression von Stammzell-Marker
- Nehmen Sie etwa 2-3 ml Sphere Kulturen von Tag 18 bis 21.
- Pellet die Kugeln bei 1.200 rpm für 5 min und saugen alle Medium.
- Isolieren von RNA aus den Bereichen mit dem RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA).
- Bewerten RNA Reinheit durch Spektrometrie und Agarosegel. </ Li>
- Synthesize cDNA (Omniscript Reverse Transkriptase (Qiagen)) unter Verwendung der gesamten zellulären RNA als Vorlage.
- Überprüfen Sie die Stammzell-Marker durch Realtime-PCR unter Verwendung der Primer für Stammzell-Marker (siehe Tabelle 1) in einem Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) mit einer Konzentration von 375 nM von jedem Primer und 50 ng Template in einem 20 ul Reaktionsvolumen. GAPDH als endogene Kontrolle verwendet.
- Für die Amplifikation verwenden eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 2,5 min gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 5 Sekunden und 60 ° C für 20 sek.
- Analysieren Sie den Lauf mit der 2 (ΔΔCt)-Methode 8.
5. Gerichteten Differenzierung in die glatten Muskelzellen
- Spheres von Tag 21 bis 26 wurden in 6-Well-Kulturschalen (BD Falcon) in SKP ausplattiert.
- Man ließ die Zellen anhaften und von den Kugeln in SKP Medium herauswachsen für 72 Stunden.
- Glatte Muskelzellen (SMC) differentiatIonen gestartet eingeleitet ersetzt durch das Medium mit SMC Differenzierung, das aus hoch-Glucose modifizierten Eagle-Dulbecco-Medium (Invitrogen), enthaltend 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen) und 2,5 ng / ml TGF-b1 (Invitrogen) .
- Das Medium wurde alle 3 Tage mit frisch zubereiteten SMC Differenzierungsmedium für einen Zeitraum von 3 bis 4 Wochen in Kultur.
- Screening für SMC-Marker wurde nach 3 bis 4 Wochen durch Immunhistochemie durchgeführt.
- Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Min. fixiert.
- Die Zellen wurden mit PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 für 30 Minuten permeabilisiert.
- Die Zellen wurden mit Antikörpern gegen αSMA (MO851, Dako, 1:100) oder Calponin (M3556, Dako, 1:100) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weiterverarbeitet, wie in 3.12 beschrieben) bis 3,15) inkubiert.
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Representative Results
Wir zeigen, dass eine Population von Zellen, die selektiv zu erweitern, um SKP Sphären unter kontrollierten Wachstumsbedingungen bestehend aus EGF und FGF2 erzeugen in primären dermalen Fibroblasten-Kulturen (Abb. 1) sind, wie wir vor kurzem 7 gemeldet.
Fibroblasten-Kulturen aus PPD 15 bis 25, die üblicherweise für den Fibroblasten-Stämme erhältlich Zellbanken entsprechen, wurden in dieser Studie verwendet. Fibroblasten-Kulturen hat dem Doppel-Behandlung, bestehend aus Kälte Behandlung zusammen mit Nahrung Erschöpfung für 24 h in diesem Verfahren beschriebenen reproduzierbar erzeugt Kulturen mit schwimmenden Kugeln (auch als Embryoidkörper EB bezeichnet), die ähnliche Eigenschaften wie das Wachstum einer zuvor beschrieben für SKPs direkt abgeleitet von Hautproben 7, 9.
Hier zeigen wir, dass die Verwendung der Methode, die wir vor kurzem berichtet, 7, haben wir eine Bevölkerung von ce isolierenlls von primären Fibroblasten Kulturen, die ähnliche Eigenschaften aufweisen, um den multipotent neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, isoliert und identifiziert in Mensch und Maus Dermis mit Neurosphäre Kulturbedingungen 5, 10, 11. Diese aus primären humanen Fibroblasten Kulturen SKP-abgeleitet zeigen sich selbst erneuernde Potenz, da sie erweitert und passagiert für mindestens einen Zeitraum von drei Monaten in vitro (siehe Methode Abschnitt). Wenn Kugeln einer Größe von 150 bis 200 um im Durchmesser erreicht nach 18 bis 21 Tagen in Kultur wurden sie mechanisch nach unten in einem Durchschnitt von 50 um Durchmesser gebrochen und darf in Suspensionskultur wieder auszubreiten in SKP Medium. Diese kaputten Kugeln durften wachsen, bis sie 200 pM vor ist wieder wie im Verfahren beschrieben passagiert erreicht. SKP Kugeln könnte mindestens dreimal passagiert werden. Diese Beobachtung zeigt, dass die Zellen innerhalb der Kugeln in der Lage, sich selbst zu erneuern und zu erweitern unter Neurosphäre Kulturbedingungen wie o warenthers und wir berichteten 5, 7.
Darüber hinaus äußerte diese SKP Zellen aus Fibroblastenkulturen abgeleitet Neuralleiste und Neuron Stammzellmarker nestin sowie die embryonalen Stammzellen Transkriptionsfaktoren Oct4 und Nanog und pluripotent Zelloberflächenmarker TG30 (Abbildung 2), ähnlich wie bei der SKP direkt von der Haut abgeleitet Biopsien 5, 7, 10. Immunhistochemie auf SKP Kugeln angedeutet nestin positives Signal im Zytoplasma zeigten 4. Oktober eine unterbrochen Kernsignal und Nanog zeigte eine diffuse Kernsignal (Abbildung 2). Darüber hinaus gab der Zelloberflächenmarker von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen TG30 eine positive Cytoplasmamembran Färbung auf SKP Sphäre Zubereitungen (Abbildung 2). Mit real time PCR, haben wir auch bestätigte die Anwesenheit von mRNAs Nestin und Oct4 in RNA-Präparation von SKP Sphären von Tag 18 in Kultur gesammelt (Abbildung 3 isoliert 5,10 abgeleitet berichtet auszudrücken. Zur weiteren Prüfung der Multipotenz der SKP aus Fibroblastenkulturen abgeleitet, induziert wir diese Zellen in die glatten Muskelzellen (Abbildung 4) zu unterscheiden. Nach 3 Wochen Induktion in einem Medium, die Wachstumsfaktoren PDGF-BB und TGF-b1 12. Immunzytochemie bestätigt die Expression der SMC Markern αSMA, Calponin in der SMCs aus diesen SKPs abgeleitet (Abb. 4).
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Verfahren und SKP Kugeln aus primären Fibroblastenkulturen isoliert ähnliche Eigenschaften teilen, die, die aus Hautbiopsien abgeleitet und muss von einem adulten Stammzellen Wohnbevölkerung innerhalb der menschlichen Haut Dermis ableiten.
| Name | Entrez ID | Primersequenz | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC TTT GGG TG |
Tabelle 1. Liste der Primer für die real time PCR und qPCR eingesetzt.
| Antikörper | Gesellschaft | Katalog-Nummer | Kommentare |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| Anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| Anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| Anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| Anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| Anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 Esel-anti-Kaninchen-IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 Esel-anti-Maus-IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 Esel-anti-Maus-IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 Esel-anti-Kaninchen-IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabelle 3. Liste von Antikörpern Ursprungs.
Abbildung 1. Isolation von SKPs aus primären Fibroblastenkulturen. Verfahren zur SKP Sphäre Kultur ab primäre Hautfibroblasten Kulturen GMO3349C bei Passage 12 skizziert. Tag 0 zeigt die Start Fibroblastensuspension in SKP Nährmedium. Tag 4 sichtbare Bereich Bildung. Tag 17 zeigt eine typische 3D SKP Sphäre. Maßstab: 50 mm und 100 um, wie angegeben.arge.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung von SKP Kugeln aus primären Fibroblastenkulturen abgeleitet. Immunfluoreszenzanalyse auf SKPs von primären humanen Fibroblasten-Kulturen (GMO3349C) abgeleitet durchgeführt. Sphere von Tag 16 wurden auf Objektträgern aufgebracht und gefärbt mit anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 und Anti-Nanog Antikörpern wie angegeben. Die Kerne wurden mit einem DNA-Farbstoff DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstab:. Mm 20 Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Glatte Muskelzellen abgeleitet von SKP-Kugeln aus primären Fibroblastenkulturen isoliert. SKP-Kugeln aus Fibroblasten gewonnen wurden angewiesen, in die glatten Muskelzellen (SMC) zu unterscheiden. (A) Phase Kontrastabbildung rekapituliert die verschiedenen Kultur Schritte von der SKP Bereich Kultur zur Differenzierung SMC (oberes Bild). (B) von SMC SKP Kugeln abgeleitet wurden für die angegebenen SMC Marker immungefärbt, α-smooth Muskelactin (αSMA) und Calponin wie angegeben. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens können naiven dermale Stammzellen aus primären dermalen Fibroblasten Kulturen isoliert werden. Mit diesem Ansatz haben wir vor kurzem berichtet, die Isolierung und Charakterisierung von adulten Stammzellen aus Fibroblastenkulturen von Patienten mit einer seltenen genetischen Syndrom, Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom 7 abgeleitet. Wie hier zeigen diese Vorläuferzellen express Stammzell-Marker sind in der Lage sich selbst zu erneuern und gerichtet in verschiedenen zellulären Linien einschließlich Fibroblasten und glatten Muskelzellen (siehe 4 von Wenzel et al. Figur, 2012) 7 unterscheiden. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile gegenüber dem Verfahren bisher zur Isolierung von SKPs aus Säugetier Hautproben 10 gemeldet. SKP kann sich von primären Fibroblasten Kulturen, die entweder frisch aus Hautbiopsien oder von primären Fibroblasten Kulturen, die bereits vorhanden sind, festgestellt werden isoliert und erhalten werden kannvon Zelle Banken auf der ganzen Welt. Dieser neue Ansatz bietet die Möglichkeit, die Auswirkungen von adulten Stammzellen in der Pathogenese verschiedener genetischer und seltene Krankheiten, für die Hautproben sind nicht ohne weiteres verfügbar studieren. Schließlich bietet diese Methode ein Fenster der Gelegenheit zu adulten Stammzellen Biologie erforschen und sezieren deren Auswirkungen während der physiologischen und Krankheitszustand. Zusammenfassend bietet dieser Ansatz eine neue und schnelle Art und Weise auf die Haut abgeleiteten Vorläuferzellen zu isolieren.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung (5090371), der Christine Kühne Center for Allergy Research and Education (CK-CARE) und dem Bayerischen Staatsministerium (KD) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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