Analisi del ciclo cellulare dal vivo di<em> Drosophila</em> I tessuti utilizzando l'Sintonizzatevi Acoustic Concentrandosi Cytometer e Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
Summary
Un protocollo per l'analisi del ciclo cellulare di vivere<em> Drosophila</em> Tessuti utilizzando l'Sintonizzatevi Acoustic Concentrandosi Cytometer è descritto. Questo protocollo fornisce contemporaneamente informazioni sulla dimensione di cella relativo, numero di cellulare, il contenuto di DNA e di tipo cellulare tramite lineage tracing o l'espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti<em> In vivo</em>.
Abstract
Citometria di flusso è stato ampiamente utilizzato per ottenere informazioni sul contenuto di DNA in una popolazione di cellule, per inferire percentuali relative a diverse fasi del ciclo cellulare. Questa tecnica è stata estesa con successo ai tessuti mitotici dell'organismo modello Drosophila melanogaster per studi genetici di regolazione del ciclo cellulare in vivo. Quando accoppiato con cellule di tipo espressione della proteina fluorescente specifico e manipolazioni genetiche, si possono ottenere informazioni dettagliate sui effetti sul numero di cellulare, la dimensione delle cellule e del ciclo cellulare graduale in vivo. Tuttavia questo metodo live-cell è basata sull'uso della cellula permeabile colorante Hoechst 33342 DNA ad intercalazione, limitando gli utenti a citofluorimetri equipaggiati con un laser UV. Abbiamo modificato questo protocollo per usare un colorante più nuovo live-cell DNA, Vybrant DyeCycle viola, compatibile con i più comuni laser viola 405nm. Il protocollo qui presentata consente di analisi del ciclo cellulare efficiente accoppiato con cellatipo, dimensione relativa cella ed informazioni di numero cellulare, in una varietà di tessuti di Drosophila. Questo protocollo estende il ciclo cellulare tecnica utile per analisi Drosophila tessuti vivi ad un piccolo analizzatore da banco, la Attune Acoustic Focusing citometro, che può essere eseguito e mantenuto su scala di laboratorio singolo.
Introduction
Citometria di flusso può essere utilizzato per misure di vitalità cellulare, dimensione cella relativo, contenuto di DNA e l'espressione della proteina fluorescente in popolazioni di cellule vive. Dovuto alla replicazione del DNA nucleare durante la fase S, informazioni sul contenuto di DNA in una popolazione di cellule può essere utilizzato per inferire relative percentuali in diverse fasi del ciclo cellulare 1-3. Questo metodo è diventato una pietra miliare della analisi del ciclo cellulare in sistemi modello dal lievito ai mammiferi.
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è diventato un sistema ottimo modello per genetica nelle analisi in vivo di regolazione del ciclo cellulare. Gli ampi strumenti genetici disponibili in mosche permettono manipolazioni specifiche del tessuto elegante e temporalmente regolamentato di regolatori del ciclo cellulare con in fluorescente lignaggio a base di proteine in vivo tracciamento 4-6. Citometria a flusso è stato utilizzato per studiare contenuto di DNA in un certo numero di tipi di cellule di Drosophila, compresi endoreplicating cellule e cellule mitotiche in coltura 7,8. Un importante passo avanti per gli studi del ciclo cellulare in vivo è stata fatta da de la Cruz e Edgar, con lo sviluppo di un protocollo per l'analisi citofluorimetrica di diploidi Drosophila dischi immaginali vivo 9,10, un protocollo che è stato usato e adattato da molti laboratori. Questa tecnica, quando accoppiato con genetico in vivo lineage tracing via inducibile espressione della proteina fluorescente e l'etichettatura specifica dei tessuti, permette di ottenere informazioni sugli effetti di manipolazione genica in tempo di raddoppiamento cellulare globale, la dimensione delle cellule e per determinare precisa tempistica delle fasi del ciclo cellulare in vivo 9 , 11. Tuttavia questo metodo si è finora fondata sull'uso della cellula permeabile colorante Hoechst 33342 DNA ad intercalazione di macchiare e quantificare il DNA in cellule vive, che ha limitato agli utenti di fluire cytometers con un laser UV in grado di eccitare il colorante Hoechst. Questi si trovano generalmente solo in selezionatrici (cioè BD FACS Vantage, BD FACSAria) o costosi sistemi da banco multicolor (cioè BD LSR), di solito richiedono il supporto di strutture di base del flusso istituzionali.
Abbiamo modificato il protocollo Hoechst-based per utilizzare un nuovo colorante DNA live-cell da Invitrogen, Vybrant DyeCycle Viola. Questa tintura è compatibile con una viola del laser 405 nm, più comune negli analizzatori da banco più piccoli e disponibili nel piccolo analizzatore da banco self-contained, l'Acoustic Sintonizzatevi Concentrandosi Cytometer. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'analisi del ciclo cellulare che può essere accoppiato con tipo di cellula, dimensione cellulare, numero di cellulare e analisi lineage in una varietà di tessuti Drosophila durante le varie fasi di sviluppo utilizzando DyeCycle Violet e la Attune. Questo protocollo si espande il numero di cytometers adatti per tale analisi con i tessuti di Drosophila e fornisce esempi di come questo tipo di analisi del ciclo cellulare in diretta può essere modificato per i tipi di tessuto supplementari e fasi di sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto consente l'analisi del ciclo cellulare, la dimensione di cella relativa e il numero di cella relativa in vivo tessuti di Drosophila a vari stadi di sviluppo. Se questa analisi è accoppiato con cellule di tipo espressione della proteina fluorescente specifico o lignaggio rintracciamento, informazioni dettagliate possono essere ottenute su risposte cellulari ciclo cellulare discreto o perturbazioni di crescita. Come prova di principio, abbiamo perturbato quiescenza nel cervello de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Aida de la Cruz per lo sviluppo e l'insegnamento del protocollo originale su cui si basa questa versione 10. Work in Buttitta Lab è sostenuto da NIH concedere GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
