라이브 세포주기 분석<em> 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여> 조직
Summary
라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜<em> 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에 사용> 조직이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 동시에 혈통 추적 또는 형광 단백질의 조직 별 발현을 통해 상대 셀 크기에 대한 정보, 휴대폰 번호, DNA 함량과 세포 유형을 제공<em> 생체 내</em>.
Abstract
유동 세포 계측법은 널리 다른 세포주기 단계에서 상대적 비율을 추론하는 세포의 인구 DNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 사용되었습니다. 이 기술은 성공적으로 생체 내에서 세포주기 조절의 유전 연구의 모델 생물 초파리의 유사 분열 조직으로 확장되었습니다. 셀 타입 특정 형광 단백질 발현과 유전자 조작과 함께 사용할 경우, 하나의 세포 수, 세포의 크기와 생체 내에서 단계적으로 세포주기에 미치는 영향에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나이 살아있는 세포 방법은 UV 레이저가 장착 흐름 cytometers에 사용자를 제한, 세포 투과성 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료의 사용에 의존하고있다. 우리는보다 일반적인 보라색 405nm는 레이저와 호환되는 새로운 살아있는 세포 DNA 염료, Vybrant DyeCycle 바이올렛을 사용하려면이 프로토콜을 수정했습니다. 여기에 제시 프로토콜은 세포와 결합 효율적으로 세포주기 분석 할 수 있습니다초파리 조직의 다양한 유형, 상대 셀 크기와 세포 수 정보. 이 프로토콜은 단일 실험실 수준에서 실행 및 관리 할 수있는 작은 벤치 톱 분석기 라이브 초파리 조직에 대한 유용한 세포주기 분석 기술, 조율 어쿠스틱 초점 cytometer에를 확장합니다.
Introduction
유동 세포 계측법은 세포 생존, 상대 셀 크기, DNA의 콘텐츠 및 라이브 세포 인구의 형광 단백질 발현의 측정에 사용하실 수 있습니다. S 상, 세포의 인구의 DNA 함량에 대한 정보 중에 핵 DNA의 복제로 인해 다른 세포주기 단계 1-3에서 상대 비율을 추론 할 수 있습니다. 이 방법은 효모에서 포유 동물 모델 시스템에서 세포주기 분석의 초석이되고있다.
초파리 초파리 세포주기 조절의 생체 내 분석에서 유전을위한 훌륭한 모델 시스템이되었다. 파리에서 사용할 수있는 광범위한 유전 도구는 생체 내 형광 단백질 기반의 혈통에 4-6 추적과 함께 세포주기 규제의 우아한 조직의 특정한 시간적 규제 조작을 허용합니다. 유동 세포 계측법은 endorepl 포함, 초파리 세포 유형의 숫자에 DNA 함량을 연구하는 데 사용되었습니다세포 배양 유사 분열 세포에게 7,8 icating. 생체 세포주기 연구를위한 중요한 사전은 라이브 배체 초파리 상상의 디스크 9,10의 유세포 분석, 많은 실험실에서 사용 적응 된 프로토콜에 대한 프로토콜의 개발, 데 라 크루스와 에드가에 의해 만들어졌다. 유도 형광 단백질 발현과 조직의 특정 라벨을 통해 추적 생체 혈통의 유전자와 결합 된이 기술은 생체 내 9에 하나의 전체 세포의 배가 시간, 셀 크기에 유전자 조작 효과에 대한 정보를 얻기 위해 세포주기 단계의 정확한 타이밍을 확인할 수 있습니다 11. 그러나이 방법은 지금까지 사용자가 흥미로운 훽스트 염색 할 수있는 UV 레이저 cytometers를 흐름을 제한하고 있습니다 살아있는 세포에서 DNA를 염색하고 정량화하는 세포의 사용을 투과 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료에 의존하고있다. 이들은 일반적으로 단지 분류기 (예 : BD FACS Vanta를에서 발견된다GE, BD FACSAria) 또는 고가의 여러 가지 빛깔의 벤치 탑 시스템 (예 : BD LSR), 기관 흐름의 핵심 시설로 일반적으로 필요로하는 지원을 제공합니다.
우리는 Invitrogen의, Vybrant DyeCycle 바이올렛에서 새로운 라이브 세포 DNA의 염료를 사용하는 훽스트 기반의 프로토콜을 수정했습니다. 이 염료는 더 작은 벤치 탑 분석기의 일반 및 작은 독립적 인 벤치 탑 분석기, cytometer에 집중 조율 어쿠스틱에서 사용할 수있는 보라색 405 nm의 레이저와 호환됩니다. 여기에서 우리는 DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 개발의 다양한 단계에서 세포 유형, 셀 크기, 셀 번호와 초파리 조직의 다양한 혈통 분석을 결합 할 수있는 세포주기 분석을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 초파리 조직과 같은 분석에 적합 cytometers의 수를 확장하고 살아있는 세포주기 분석이 유형의 추가 조직 유형 및 발달 단계에 맞게 수정 될 수있는 방법의 예제를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 세포주기, 상대 셀의 크기 및 상대 셀 수 다양한 발달 단계에서 라이브 초파리 조직에서 분석 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 유형의 특정 형광 단백질의 발현 또는 추적 계보와 결합 될 때, 자세한 정보는 신중 세포주기 또는 성장 섭동에 대한 세포 반응에 대해 얻을 수 있습니다. 뇌 세포가 체포 90 % G1에 일반적으로있는 경우 원칙적으로 증거로, 우리는 (3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 개발 버전이 10의 기반이되는 원래의 프로토콜을 가르치는 아이다 드 라 쿠 르스에 감사드립니다. Buttitta 연구소의 작품은 NIH 교부금 GM086517에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
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