の生細胞サイクル分析ショウジョウバエ組織

Summary

生きた細胞周期分析のためのプロトコルショウジョウバエ組織が記載されている。このプロトコルは、同時に系統トレースまたは蛍光タンパク質の組織特異的発現を介して相対セルサイズに関する情報を、細胞数、DNA含量および細胞型を提供する。

Abstract

フローサイトメトリーは、広く異なる細胞周期の段階で相対的な割合を推測する、細胞集団におけるDNAの内容に関する情報を取得するために使用されている。この技術は、正常インビボにおける細胞周期調節の遺伝学的研究のためのモデル生物キイロショウジョウバエの細胞分裂組織に拡張されている。細胞型特異的蛍光タンパク質の発現および遺伝子操作と結合するとき、いずれかのセル数、セルサイズおよびインビボでフェージング細胞周期に対する影響についての詳細な情報を得ることができる。しかしこの生細胞の方法は、UVレーザーを搭載したフローサイトメーターにユーザーを制限すること、細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきた。我々は、より一般的なバイオレット405nmのレーザーとの互換性が、新しい生細胞のDNA染料、Vybrant DyeCycleバイオレットを使用するには、このプロトコルを変更した。ここで紹介するプロトコルは、細胞と結合効率よく細胞周期分析を可能にするショウジョウバエ組織の様々なタイプの相対的なセルサイズとセル番号情報。このプロトコルは、単一実験室規模で実行し、維持することができ、小さなベンチトップ·アナライザへのライブショウジョウバエの組織のために有用な細胞周期解析手法、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターを拡張。

Introduction

フローサイトメトリーは、細胞生存率、相対的なセルサイズ、DNA含量および生細胞集団における蛍光タンパク質発現の測定に用いることができる。 S相細胞の集団におけるDNAの内容に関する情報中の核DNAの複製のためには、異なる細胞周期相^1-3の相対的な割合を推測するために使用することができる。この方法は、酵母から哺乳動物モデル系における細胞周期分析の基礎となっている。

ショウジョウバエでは、細胞周期調節のin vivo解析で遺伝するための優れたモデルシステムとなっています。ハエで利用可能な大規模な遺伝的なツールは、in vivo蛍光タンパク質ベースの系統で ^4-6トレースとともに細胞周期調節因子の優雅な組織特異的かつ時間的に調節操作が可能になります。フローサイトメトリーendorepl含む、 ショウジョウバエの細胞の種類の数にDNA含量を研究するために使用されている細胞と培養有糸分裂細胞^7,8 icating。 in vivoでの細胞周期の研究における重要な進歩のためには、ライブ二倍ショウジョウバエ成虫ディスク^9,10、多くのラボで使用され、適応されていたプロトコルのフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの開発、デ·ラ·クルスとエ....

Protocol

1。畜産を飛ばす

1. クロスは10ミリリットル酵母グルコース培地³または任意の他のタンパク質が豊富なメディアとの狭いプラスチックバイアルで目的遺伝子型のハエ。 生体蛍光タンパク質発現に使用したトレースの組織特異的発現と系統で利用広範ショウジョウバエ遺伝子導入のツールは他の場所で^4,5詳細に記載されている。 24時間子孫コレクションのシリーズを得るために毎日新鮮なバイアルに両親を転送したり、より正確なステージングのために、寒天プレート上胚を収集し^、10は、上記のようにバイアルに孵化幼虫を移す。実験全体で均一な条件を確保し、過密回避するために、単一バイアル中F1子孫の総数は100を超えてはならない。実験の遺伝的設計に応じて、必要な発達段階になるまで適切なインキュベーターにバイアルを保つ。
2. 実験動物を収集：あなたが^第 3幼虫で成熟した幼虫が必要となります正確蛹ステージング用幼虫の解剖や白前蛹（WPP）の開発のための110-120時間程度で齢（L3）。非増殖状態にスイッチを含む劇的な細胞周期の変化は、変態^12,13間に異なる時点で発生します。したがって蛹（開発の1時間以内）の正しいステージングは​​変態時の再現性の細胞周期のデータのために不可欠です。 WPPは、 図1、パネルIに示す蛹形成（0時間APF）の後に....

Results

図2に設けられたGFPテンプレートを使用して、組織の後半でGFPを発現し、幼虫の翼サンプルの代表的な結果を示す。同様の結果は、同じ組織型および未RFPテンプレート（ 図3A）を用いてRFPの発現パターンが得られる。提供されるテンプレートおよび電圧（表2）幼虫の眼（ 図3B）、脳および翼、ならびに蛹目、脳（ 図3D）と翼の分析に適している。ゲート5と6の集団のためのFSCをプロットすることによって提供される相対的なセルサイズのヒストグラムも（ 図3C）を生成することができる。ゲイツが原因異なる組織または異なるGFPまたはRFP導入遺伝子のための蛍光強度の違いのためにセルサイズの違いに少し調整する必要があります。サンプルの小テストボリューム（50μL）を実行しながら、これは、レコードを押す前に、行うことができます。

A各集団のグローバル最大値を示すヒストグラムで結果、同調させるソフトウェアで自動スケール（自動に設定.......

Discussion

ここで説明するプロトコルは、細胞周期、相対的なセルサイズおよび様々な発生段階でのライブショウジョウバエ組織の相対的な細胞数の分析を可能にする。この分析は、細胞型特異的蛍光タンパク質の発現またはトレースの系統に結合されると、詳細情報が目立たない細胞周期または成長摂動に対する細胞応答について得ることができる。原理の証明として、我々は、脳細胞が逮捕された90％のG1（ 図3D）にわたって正常にあるときに発生段階で異常なDNA複製につながる、GFP標識した細胞クローンでG1-S細胞周期調節因子を発現させることにより、蛹ハエ脳の休止を中断。

しかし、この生細胞周期分析方法にはいくつかの重要な制限がある。まず、人はここに記述されたプロトコルを使用して有糸分裂の様々な段階における細胞を区別することはできません。したがって、ここで説明する分析がimmのを補充されるべきである興味のある組織に分裂指数を定量化するなどのSer10リン酸化ヒストンH3 ¹⁸として分裂マーカーのunofluorescence染色。両.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm ポリスチレン丸底 5 ml 試験管	BD Falcon	352058	5 ml チューブ
Attune Acoustic Focusing Cytometer Life	Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC のみ
Attune Performance Tracking ビーズ (5 x 106 beads/ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	毎日のパフォーマンステスト用
Dumont #5 Inox 鉗子	Fine Science Tools	11251-20
胚皿 30 mm x 12mm	電子顕微鏡科学	70543-30	ガラス解剖皿
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
トリプシン-EDTA溶液 (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen 春はさみ	ファインサイエンスツール	15003-08	ストレート 5mm カッティングエッジ
Vybrant DyeCycle バイオレット ステイン	ライフ テクノロジーズ/ Invitrogen	V35003
表 1.必要な試薬と機器.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ 遊離PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet(これは哺乳動物細胞の推奨濃度の0.25倍であることに注意してください。高濃度はショウジョウバエ細胞に対して毒性があることがわかった。 10X Ca2+ Mg2+遊離PBS(pH7.2):1.37M NaCl、27 mM KCl、100mM Na2HPO4(二塩基性)、20mM KH2PO4(モノ塩基性)pHに調整7.2
FSC SSC BL1 VL1 しきい値(x1000) 100 10 10 10 電圧(mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2.図2.