の生細胞サイクル分析<em>ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して>組織
Summary
生きた細胞周期分析のためのプロトコル<em>ショウジョウバエ</em同調アコースティックフォーカシングサイトメーターを用い>組織が記載されている。このプロトコルは、同時に系統トレースまたは蛍光タンパク質の組織特異的発現を介して相対セルサイズに関する情報を、細胞数、DNA含量および細胞型を提供する<em生体内で></em>。
Abstract
フローサイトメトリーは、広く異なる細胞周期の段階で相対的な割合を推測する、細胞集団におけるDNAの内容に関する情報を取得するために使用されている。この技術は、正常インビボにおける細胞周期調節の遺伝学的研究のためのモデル生物キイロショウジョウバエの細胞分裂組織に拡張されている。細胞型特異的蛍光タンパク質の発現および遺伝子操作と結合するとき、いずれかのセル数、セルサイズおよびインビボでフェージング細胞周期に対する影響についての詳細な情報を得ることができる。しかしこの生細胞の方法は、UVレーザーを搭載したフローサイトメーターにユーザーを制限すること、細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきた。我々は、より一般的なバイオレット405nmのレーザーとの互換性が、新しい生細胞のDNA染料、Vybrant DyeCycleバイオレットを使用するには、このプロトコルを変更した。ここで紹介するプロトコルは、細胞と結合効率よく細胞周期分析を可能にするショウジョウバエ組織の様々なタイプの相対的なセルサイズとセル番号情報。このプロトコルは、単一実験室規模で実行し、維持することができ、小さなベンチトップ·アナライザへのライブショウジョウバエの組織のために有用な細胞周期解析手法、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターを拡張。
Introduction
フローサイトメトリーは、細胞生存率、相対的なセルサイズ、DNA含量および生細胞集団における蛍光タンパク質発現の測定に用いることができる。 S相細胞の集団におけるDNAの内容に関する情報中の核DNAの複製のためには、異なる細胞周期相1-3の相対的な割合を推測するために使用することができる。この方法は、酵母から哺乳動物モデル系における細胞周期分析の基礎となっている。
ショウジョウバエでは、細胞周期調節のin vivo解析で遺伝するための優れたモデルシステムとなっています。ハエで利用可能な大規模な遺伝的なツールは、in vivo蛍光タンパク質ベースの系統で 4-6トレースとともに細胞周期調節因子の優雅な組織特異的かつ時間的に調節操作が可能になります。フローサイトメトリーendorepl含む、 ショウジョウバエの細胞の種類の数にDNA含量を研究するために使用されている細胞と培養有糸分裂細胞7,8 icating。 in vivoでの細胞周期の研究における重要な進歩のためには、ライブ二倍ショウジョウバエ成虫ディスク9,10、多くのラボで使用され、適応されていたプロトコルのフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの開発、デ·ラ·クルスとエドガーによって作られた。誘導性蛍光タンパク質の発現および組織特異的標識を介してトレースをインビボ系統の遺伝子と結合この技術は、 インビボ 9 のいずれかの全体的な細胞倍加時間、セルサイズに遺伝子操作への影響に関する情報を取得し、細胞周期相の正確なタイミングを決定することができ、11。しかし、この方法では、これまでユーザーがエキサイティングヘキスト染料のできるUVレーザーでメーターを流れるように制限されている生きた細胞内でDNAを染色し、定量化するための細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきました。これらは一般のみソーター（ つまり BD FACS Vantaで発見されていGE、BD FACSAria）や高価な多色ベンチトップシステム（ つまり BD LSR）、通常の機関流れ中核施設でサポートを必要とする。
私たちは、インビトロジェン、Vybrant DyeCycleバイオレットから新しい生細胞のDNA染料を使用するヘキストベースのプロトコルを変更した。この染料は、小さな自己完結型のベンチトップ·アナライザ、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターより小さい卓上型アナライザーに共通および利用可能なバイオレット405 nmのレーザー、互換性があります。ここでは、DyeCycleバイオレットと同調を用いた開発のさまざまな段階でショウジョウバエ組織の様々な細胞型、セルサイズ、セル数および系統解析と結合することができる細胞周期分析のための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、 ショウジョウバエ組織を有するそのような分析に適したメーターの数を拡大し、生細胞周期分析のこのタイプは、追加の組織の種類および発達段階のために変更することができる方法の例を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、細胞周期、相対的なセルサイズおよび様々な発生段階でのライブショウジョウバエ組織の相対的な細胞数の分析を可能にする。この分析は、細胞型特異的蛍光タンパク質の発現またはトレースの系統に結合されると、詳細情報が目立たない細胞周期または成長摂動に対する細胞応答について得ることができる。原理の証明として、我々は、脳細胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、このバージョンは10基になっているオリジナルのプロトコルを開発し、教えるためアイーダ·デ·ラ·クルスに感謝します。 Buttittaラボでの仕事は、NIHの助成金GM086517によってサポートされています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
