Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em> Drosophila</em> Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain
Summary
Un protocolo para el análisis del ciclo celular en vivo de<em> Drosophila</em> Tejidos usando la Acoustic Attune citómetro de enfoque se describe. Este protocolo proporciona simultáneamente información sobre el tamaño relativo de células, el número de células, y el tipo de contenido de ADN celular a través de rastreo de linaje o expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes<em> In vivo</em>.
Abstract
La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para obtener información sobre el contenido de ADN en una población de células, para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular. Esta técnica se ha ampliado con éxito a los tejidos mitóticas del organismo modelo Drosophila melanogaster para los estudios genéticos de la regulación del ciclo celular in vivo. Cuando se combina con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico y manipulaciones genéticas, se puede obtener información detallada acerca de los efectos sobre el número de células, el tamaño celular y el ciclo celular en la eliminación in vivo. Sin embargo este método en vivo de células se ha basado en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante, limitar a los usuarios a citómetros de flujo equipado con un láser UV. Hemos modificado este protocolo para utilizar un tinte más reciente en vivo de células de ADN, Vybrant DyeCycle Violet, compatible con el láser violeta 405nm más común. El protocolo presentado aquí permite el análisis del ciclo celular eficiente junto con célulastipo, tamaño relativo de células y la información de número de células, en una variedad de tejidos de Drosophila. Este protocolo se extiende la técnica útil para el análisis del ciclo celular de Drosophila tejidos en vivo para un pequeño analizador de sobremesa, la acústica Attune citómetro de enfoque, que puede ser gestionado y mantenido en una escala de laboratorio-único.
Introduction
La citometría de flujo puede ser utilizado para las mediciones de la viabilidad celular, tamaño de la celda relativa, contenido de ADN y la expresión de la proteína fluorescente en las poblaciones de células vivas. Debido a la replicación de ADN nuclear durante la fase S, la información sobre el contenido de ADN en una población de células puede ser usado para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular 1-3. Este método se ha convertido en una piedra angular del análisis del ciclo celular en sistemas modelo de la levadura a los mamíferos.
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un excelente sistema modelo para la genética en los análisis in vivo de la regulación del ciclo celular. Las amplias herramientas genéticas disponibles en las moscas permiten manipulaciones tejido elegante específicos y regulado temporalmente de los reguladores del ciclo celular, junto con la fluorescente linaje a base de proteínas vivo trazado 4-6. La citometría de flujo se ha utilizado para estudiar el contenido de ADN en un número de tipos de células de Drosophila, incluyendo endoreplcélulas cultivadas y células mitóticas icating 7,8. Un avance importante para los estudios del ciclo celular in vivo fue hecha por de la Cruz y Edgar, con el desarrollo de un protocolo para el análisis citométrico de flujo de discos imaginales de Drosophila diploides vivo 9,10, un protocolo que se ha utilizado y adaptado por muchos laboratorios. Esta técnica, cuando se combina con linaje genético en el rastreo in vivo a través de la expresión de proteína inducible fluorescente y el etiquetado específico de tejido, permite obtener información acerca de la manipulación de genes efectos sobre el tiempo de duplicación celular global, tamaño de celda y para determinar el momento exacto de fases del ciclo celular in vivo 9 , 11. Sin embargo, este método se ha basado hasta ahora en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante para teñir y cuantificar el ADN en las células vivas, lo que ha limitado los usuarios fluyan citómetros con un láser UV capaz de excitar el colorante Hoechst. Estos generalmente se encuentran sólo en los clasificadores (es decir BD FACS Vantage, BD FACSAria) o costosos sistemas de sobremesa multicolor (es decir BD LSR), por lo general requieren el apoyo de las instalaciones básicas de flujo institucionales.
Hemos modificado el protocolo Hoechst basado en utilizar un nuevo tinte de ADN de células vivas de Invitrogen, Vybrant DyeCycle violeta. Este colorante es compatible con un láser violeta de 405 nm, más común en los analizadores de sobremesa más pequeños y están disponibles en el pequeño analizador de sobremesa autónomo, la acústica Attune Centrándose citómetro. Aquí se presenta un protocolo detallado para el análisis del ciclo celular que se puede acoplar con el tipo de células, tamaño de celda, el número de células y el análisis de linaje en una variedad de tejidos de Drosophila durante las diversas etapas de desarrollo utilizando DyeCycle violeta y la Attune. Este protocolo se expande el número de citómetros adecuados para este tipo de análisis con los tejidos de Drosophila y proporciona ejemplos de cómo este tipo de análisis del ciclo celular en vivo puede ser modificado para tipos de tejidos adicionales y etapas de desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo se describe aquí permite el análisis de ciclo celular, tamaño de celda relativo y el número relativo de células en los tejidos de Drosophila en directo en diversas etapas de desarrollo. Cuando este análisis se acopla con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico o linaje de rastreo, la información detallada se puede obtener sobre las respuestas celulares a ciclo celular discreta o perturbaciones de crecimiento. Como prueba de principio, hemos desbaratado quiescen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Aida de la Cruz para el desarrollo y la enseñanza del protocolo original en que se basa esta versión 10. El trabajo en el laboratorio Buttitta está apoyado por el NIH GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
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