Жить анализ клеточного цикла<em> Drosophila</em> Тканей с использованием акустической Attune Фокусировка Цитометр и Vybrant DyeCycle Фиолетовое пятно ДНК
Summary
Протокол для клеточного цикла анализа живых<em> Drosophila</em> Тканей с использованием Attune акустической фокусировки цитометра описано. Этот протокол одновременно предоставляет информацию о относительный размер ячейки, число клеток, содержание ДНК и клеточного типа с помощью отслеживания клонов или ткани специфической экспрессии флуоресцентных белков<em> В естественных условиях</em>.
Abstract
Проточная цитометрия широко используется для получения информации о ДНК в популяции клеток, чтобы вывести относительное процентное в различных фазах клеточного цикла. Этот метод был успешно распространен на митотических тканях модельного организма дрозофилы для генетических исследований регуляции клеточного цикла в естественных условиях. В сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка и генетических манипуляций, можно получить подробную информацию о влияние на количество клеток, размеров клеток и клеточного цикла постепенно в естественных условиях. Однако эта живых клеток метод опирается на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя, ограничивая пользователей проточных цитометров оснащен УФ-лазера. Мы модифицировали этот протокол использовать новые живых клеток ДНК краситель, Vybrant DyeCycle фиолетовый, совместимый с более распространенными фиолетовый 405 нм лазер. Протокол, представленные здесь позволяет проводить эффективный анализ клеточного цикла в сочетании с ячейкитип, относительный размер ячейки и информация количество клеток, в различных тканях дрозофилы. Этот протокол расширяет полезную клеточного цикла анализа для живых тканей Drosophila в небольшой настольный анализатор, Attune Акустическая Цитометр фокусировки, которая может быть запущена и поддерживается на одном-лабораторном масштабе.
Introduction
Проточная цитометрия может быть использован для измерения жизнеспособности клеток, относительный размер ячейки, содержание ДНК и флуоресцентные экспрессии белка в клеточной популяции живых. Благодаря репликации ядерной ДНК во время S-фазы, информацию о содержание ДНК в популяции клеток может быть использована для вывода относительное процентное в различных фазах клеточного цикла 1-3. Этот метод стал краеугольным камнем анализа клеточного цикла в модельных системах от дрожжей до млекопитающих.
Плодовой мушки дрозофилы стал отличным модели системы для генетического анализа в естественных условиях регуляции клеточного цикла. Обширные генетические инструменты, доступные в мухи позволяют элегантные ткани и во времени конкретных манипуляций регулируется регуляторов клеточного цикла, а также в естественных условиях флуоресцентного белка на основе отслеживания клонов 4-6. Проточная цитометрия был использован для изучения ДНК в число типов Drosophila клеток, включая endoreplicating клетки и культивируемые клетки митотического 7,8. Важный шаг вперед в естественных исследований клеточного цикла был сделан де ла Круз и Эдгар, с развитием протокола для анализа методом проточной цитометрии живых диплоидных Drosophila дисков имагинальных 9,10, протокол, который был использован и адаптирован многих лабораторий. Этот метод, в сочетании с генетической линии в естественных условиях трассировки через индуцибельной экспрессии белка флуоресцентные и тканей конкретных маркировки, позволяет получить информацию о генной инженерии воздействие на общее время удвоения клетки, размер ячейки и определить точную синхронизацию фаз клеточного цикла в естественных условиях 9 11. Однако этот метод до сих пор полагались на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя для окрашивания и количественной оценки ДНК в живых клетках, которая ограничивает пользователей течь цитометрии с помощью УФ лазер, способным возбуждать краситель Hoechst. Как правило, они встречаются только в сортировщики (т.е. BD FACS VantaGE, BD FACSAria) или дорогие многоцветные настольных систем (т.е. BD LSR), как правило, требующие поддержки со стороны институциональных средств основного потока.
Мы модифицировали Hoechst протокол на основе использования новых живых клеток ДНК красителя из Invitrogen, Vybrant DyeCycle фиолетового. Этот краситель совместим с фиолетовыми 405 нм лазер, чаще в небольших настольных анализаторов и доступны в небольших автономных настольный анализатор, Attune Акустическая Фокусировка Цитометр. Здесь мы представляем подробный протокол для сотовых анализ цикла, которое может быть связано с типом клеток, размер ячейки, номер клетки и линии анализа в различных тканях дрозофилы на различных этапах развития с использованием DyeCycle Фиолетовый и Attune. Этот протокол расширяет количество цитометры подходящих для такого анализа с тканями Drosophila и примеры того, как этот тип живого анализа клеточного цикла могут быть модифицированы для дополнительных типов тканей и стадиях развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь позволяет анализ клеточного цикла, относительного размера ячейки и относительные количества клеток в живых тканях дрозофилы на различных стадиях развития. Когда этот анализ в сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка или отс…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Аида де ла Крус для разработки и преподавания оригинального протокола, на которой эта версия основана 10. Работа в Лаборатории Buttitta поддерживается NIH грант GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
