De cellules vivantes analyse du cycle de<em> Drosophila</em> Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer Concentrer et Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain
Summary
Un protocole pour l'analyse du cycle cellulaire de vivants<em> Drosophila</em> Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer mise au point est décrit. Ce protocole fournit simultanément des informations sur la taille relative de la cellule, le nombre de cellules, la teneur en ADN et le type de cellule via lignée de traçage ou de l'expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes<em> In vivo</em>.
Abstract
La cytométrie en flux a été largement utilisé pour obtenir des informations sur le contenu de l'ADN dans une population de cellules, de déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire. Cette technique a été étendu avec succès aux tissus de la mitose de l'organisme modèle Drosophila melanogaster pour les études génétiques de la régulation du cycle cellulaire in vivo. Lorsqu'il est couplé avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique de type cellulaire et les manipulations génétiques, on peut obtenir des informations détaillées sur les effets sur le nombre de cellules, la taille des cellules et cycle cellulaire élimination in vivo. Cependant, cette méthode cellules vivantes a misé sur l'utilisation de la cellule perméable Hoechst 33342 DNA-intercalant, limitant les utilisateurs à cytomètres équipé d'un laser UV. Nous avons modifié ce protocole à utiliser un colorant plus récent ADN des cellules vivantes, Vybrant DyeCycle Violet, compatible avec le laser violet 405nm plus commun. Le protocole présenté ici permet une analyse du cycle cellulaire efficace couplé avec cellulele type, la taille relative de la cellule et des informations de nombre de cellules, dans une variété de tissus de Drosophila. Ce protocole étend la technique utile du cycle cellulaire d'analyse des tissus vivants drosophile à un petit analyseur de paillasse, le Attune acoustique Cytometer mise au point, qui peut être exécuté et maintenu sur une échelle unique laboratoire.
Introduction
La cytométrie en flux est utilisée pour les mesures de viabilité des cellules, la taille des cellules par rapport, le contenu de ADN et l'expression de la protéine fluorescente dans les populations de cellules vivantes. En raison de la réplication de l'ADN nucléaire au cours de la phase S, des informations sur la teneur en ADN dans une population de cellules peuvent être utilisées pour déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire 1-3. Cette méthode est devenue une pierre angulaire de l'analyse du cycle cellulaire dans des systèmes modèles de la levure aux mammifères.
La mouche Drosophila melanogaster est devenu un excellent modèle pour génétique analyses in vivo de la régulation du cycle cellulaire. Les outils génétiques disponibles dans de vastes mouches permettent des manipulations tissu élégant précis et régulé temporellement des régulateurs du cycle cellulaire ainsi que dans la lignée à base de protéine fluorescente in vivo traçage 4-6. La cytométrie en flux a été utilisée pour étudier la teneur en ADN dans un certain nombre de types de cellules de drosophile, y compris endoreplet les cellules en mitose culture intoxicantes 7,8. Une avancée importante pour les études du cycle cellulaire in vivo a été faite par de la Cruz et Edgar, avec l'élaboration d'un protocole pour l'analyse par cytométrie de flux de diploïdes direct drosophile imaginales disques 9,10, un protocole qui a été utilisé et adapté par de nombreux laboratoires. Cette technique, couplée avec génétique dans la lignée vivo traçage via l'expression de la protéine fluorescente inductible et l'étiquetage spécifique des tissus, permet d'obtenir des informations sur les effets de manipulation génétique sur le temps de doublement des cellules dans l'ensemble, la taille des cellules et de déterminer le moment précis de phases du cycle cellulaire in vivo 9 , 11. Cependant cette méthode n'a jusqu'à présent compté sur l'utilisation de la cellule perméable Hoechst 33342 de colorant intercalant d'ADN pour colorer et quantifier l'ADN dans des cellules vivantes, ce qui a limité les utilisateurs de s'écouler cytomètres avec un laser UV capable d'exciter le colorant Hoechst. Ceux-ci se trouvent généralement que dans trieurs (c. BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou coûteux systèmes de paillasse multicolore (c.-à-BD LSR), nécessitant habituellement un soutien par institutionnels installations de base de flux.
Nous avons modifié le protocole Hoechst basée à utiliser un nouveau colorant de l'ADN des cellules vivantes chez Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Ce colorant est compatible avec un laser violet de 405 nm, plus fréquente chez les petits analyseurs de paillasse et disponible dans le petit analyseur de paillasse autonome, l'acoustique Attune concentrer Cytometer. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'analyse du cycle cellulaire qui peut être couplé avec le type de cellule, la taille de la cellule, le nombre de cellules et l'analyse de la lignée dans une variété de tissus drosophile à divers stades de développement utilisant DyeCycle Violet et le Attune. Ce protocole étend le nombre de cytometers appropriés pour une telle analyse avec des tissus chez la drosophile et fournit des exemples de ce type d'analyse du cycle cellulaire en direct peut être modifié pour des types de tissus supplémentaires et des stades de développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici permet une analyse de cycle cellulaire, la taille relative de la cellule et le nombre relatif de cellules dans les tissus vivants drosophile à différents stades de développement. Lorsque cette analyse est couplée avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique du type de cellule ou lignée de traçage, des informations détaillées peuvent être obtenues sur les réponses cellulaires au cycle cellulaire discrète ou perturbations de croissance. Comme preuve de princip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Aida de la Cruz pour le développement et l'enseignement du protocole original sur lequel cette version est basée 10. Le travail dans le Buttitta Lab est soutenu par NIH GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
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Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
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