Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em> Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak> Dokular
Summary
Canlı hücre döngüsü analizi için bir protokol<em> Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometre kullanarak> dokular açıklanmıştır. Bu protokol, eş zamanlı olarak ya da floresan nesilli izleme proteinlerin doku spesifik ifade yoluyla göreli hücre boyutu ile ilgili bilgi, hücre sayısı, DNA içeriği hücre tipi içerir<em> In vivo</em>.
Abstract
Flow sitometri çok farklı hücre döngüsü aşamalarında göre yüzde anlaması için, bir hücre nüfus DNA içeriği hakkında bilgi edinmek için kullanılır olmuştur. Bu teknik başarılı in vivo hücre döngüsü düzenleme genetik çalışmalar için model organizma Drosophila melanogaster mitotik dokulara uzatıldı. Hücre türüne özgü floresan protein ekspresyonu ve genetik manipülasyonlar ile birleştiğinde, bir hücre sayısı, hücre boyutu ve in vivo olarak aşamalı hücre döngüsü üzerindeki etkileri hakkında ayrıntılı bilgi edinebilirsiniz. Ancak bu canlı hücre yöntemi UV lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde kullanıcıları sınırlayıcı, hücre geçirgen Hoechst 33.342 DNA-intercalating boya kullanımı güvendi. Biz daha yaygın mor 405nm lazer ile uyumlu yeni bir canlı hücre DNA boya, Vybrant DyeCycle Violet, kullanmak için bu protokol değiştirdiniz. Burada sunulan protokol, hücre ile birlikte verimli bir hücre döngüsü analizi sağlarDrosophila dokularda çeşitli tip, göreli hücre boyutu ve hücre sayısı bilgiler. Bu protokol tek laboratuvar ölçekte çalışan ve korunabilir bir küçük masa üstü analiz için canlı Drosophila dokular için yararlı hücre döngüsü analizi tekniği, Attune Akustik Odaklama Sitometreyi, uzanır.
Introduction
Akış sitometri hücre canlılığı, nispi hücre boyutu, DNA içeriği ve canlı hücre popülasyonunda floresan proteini ifade ölçümü için kullanılabilir. S-fazı, bir hücre popülasyonunda DNA içeriği hakkında bilgi boyunca nükleer DNA çoğaltma bağlı olarak farklı hücre döngüsü faz 1-3 görece yüzdeleri belirlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, mayadan memelilere modeli sistemlerinde hücre döngüsü analizi bir taşı haline gelmiştir.
Meyve sineği Drosophila melanogaster hücre döngüsünün düzenlenmesi in vivo analizlerde genetik için mükemmel bir model sistem haline gelmiştir. Sinekler mevcut geniş genetik araçları vivo floresan protein bazlı soy 4-6 izleme ile birlikte hücre döngüsü düzenleyicileri zarif doku özel ve geçici olarak düzenlenir manipülasyonlar için izin verir. Akış sitometri endorepl da dahil olmak üzere, Drosophila hücre tipleri arasında bir dizi DNA içeriği incelemek için kullanılmıştırhücreleri ve kültür mitotik hücreler 7,8 icating. In vivo hücre döngüsü çalışmalar için önemli bir ilerleme canlı diploid Drosophila hayali diskler 9,10 akış sitometrik analizi, birçok laboratuvar tarafından kullanılan ve adapte edilmiş bir protokol için bir protokol gelişimi ile, de la Cruz ve Edgar tarafından yapıldı. Indüklenebilir floresan protein ekspresyonu ve doku özel etiketleme ile izleme in vivo soy genetik ile birlikte bu teknik,, in vivo 9 bir genel hücre katına çıkma süresi, hücre boyutu gen manipülasyonu etkileri hakkında bilgi edinmek için ve hücre döngüsü aşamalarının hassas zamanlama belirlemenize olanak sağlar , 11. Bununla birlikte, bu yöntem, bugüne kadar kullanıcılar verici Hoechst boya yeteneğine sahip bir UV lazer sitometre akmaya sınırlı olan canlı hücreler, DNA leke ve ölçmek için hücrenin kullanımını geçirgen Hoechst 33.342 DNA intercalating boya dayanmıştır. Bunlar genellikle sadece seçmeler (yani BD FACS Vanta bulunurge, BD FACSAria) veya pahalı çok renkli masa üstü sistemleri (yani BD LSR), kurumsal akış çekirdek tesisleri tarafından genellikle gerektiren destek.
Biz Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet yeni bir canlı hücre DNA boya kullanmak için Hoechst-tabanlı protokol değiştirdiniz. Bu boya daha küçük masa üstü analiz yaygın ve küçük bağımsız masa üstü analizörü, Sitometre Odaklama Attune Akustik mevcut bir mor 405 nm lazer ile uyumludur. Burada DyeCycle menekşe ve Akort kullanılarak çeşitli gelişim aşamalarında hücre tipi, hücre boyutu, hücre sayısı ve Drosophila dokularının çeşitli soy analizi ile akuple edilebilir hücre döngüsü analizi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol Drosophila dokuları ile bu analiz için uygun sitometrelerinde sayısı genişletir ve canlı hücre döngüsü analizi bu tür ek doku tipleri ve gelişim evreleri için değiştirilebilir nasıl örnekleri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen protokole, hücre döngüsü, göreli hücre boyutu ve nispi hücre sayısı, çeşitli gelişim aşamalarında Drosophila canlı dokularda analizi için olanak sağlar. Bu analiz hücre türüne özgü floresan protein ifade veya izleme soy bağlandığı zaman, detaylı bilgi gizli hücre döngüsü veya büyüme tedirginlikler hücresel yanıtları hakkında elde edilebilir. Beyin hücreleri tutuklandı 90% G1 üzerinde normal olduğunda ilkesinin kanıtı olarak, biz (3D Şekil)<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz gelişmekte olan ve bu sürüm 10 dayandığı orijinal protokol öğretmek için Aida de la Cruz teşekkür ederim. Buttitta Laboratuarı'nda çalışma NIH hibe GM086517 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
