Live-Cell Cycle Analysis van<em> Drosophila</em> Weefsels met de Attune Acoustic Focusing Cytometer en Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
Summary
Een protocol voor celcyclus analyse gemaakt van live<em> Drosophila</em> Weefsels met behulp van de Attune Acoustic Focussen Cytometer wordt beschreven. Dit protocol geeft tegelijkertijd informatie over de relatieve cel grootte, aantal cellen, DNA-gehalte en celtype via lineage tracing of weefselspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten<em> In vivo</em>.
Abstract
Flowcytometrie is op grote schaal gebruikt om informatie over DNA gehalte te bepalen in een populatie van cellen, de relatieve percentages afleiden in verschillende fasen van de celcyclus. Deze techniek is met succes uitgebreid naar de mitotische weefsels van het modelorganisme Drosophila melanogaster voor genetische studies van de celcyclus in vivo. In combinatie met celtype-specifieke fluorescente proteïne expressie en genetische manipulaties kan men informatie over effecten op het aantal cellen, celgrootte en celcyclus geleidelijk in vivo te verkrijgen. Maar dit levende cellen methode gebaseerd op de toepassing van de cel permeabele Hoechst 33342 DNA-intercalerende kleurstof, het beperken tot flowcytometers met een UV laser. We hebben dit protocol aangepast naar een nieuwere levende cellen DNA-kleurstof, Vybrant DyeCycle Violet, verenigbaar is met de meer voorkomende violet 405 nm laser gebruiken. Het protocol hier gepresenteerde zorgt voor een efficiënte celcyclusanalyse gekoppeld aan celtype, relatieve celgrootte en celaantal informatie in verschillende Drosophila weefsels. Dit protocol breidt de bruikbare celcyclus analyse techniek voor levende Drosophila weefsels een klein tafelmodel analyzer, de Attune Acoustic Focussen Cytometer, die kan worden uitgevoerd en gehandhaafd op een single-lab schaal.
Introduction
Flowcytometrie kan worden gebruikt voor het meten van cel levensvatbaarheid relatieve celgrootte DNA inhoud en fluorescerend eiwit expressie in levende celpopulaties. Door de replicatie van nucleair DNA in S-fase over DNA-inhoud in een populatie van cellen kan worden gebruikt om de relatieve percentages afleiden in verschillende fasen van de celcyclus 1-3. Deze methode is uitgegroeid tot een hoeksteen van de celcyclus analyse in modelsystemen van gist tot zoogdieren.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is uitgegroeid tot een uitstekend modelsysteem voor genetisch in vivo analyses van de celcyclus. De uitgebreide genetische tools beschikbaar in vliegen zorgen voor een elegante weefselspecifieke en tijd gereguleerd manipulaties van celcyclus regulatoren samen met in vivo fluorescent eiwit gebaseerde lineage tracing 4-6. Flowcytometrie werd gebruikt voor DNA-gehalte bestuderen in Drosophila aantal celtypes, waaronder endoreplicating cellen en gekweekte mitotische cellen 7,8. Een belangrijke vooruitgang voor in vivo celcyclus studies werd gemaakt door de la Cruz en Edgar, met de ontwikkeling van een protocol voor flowcytometrische analyse gemaakt van live diploïde Drosophila imaginal schijven 9,10, een protocol dat is gebruikt en aangepast door vele laboratoria. Deze techniek, wanneer gekoppeld aan genetische in vivo lineage tracing via induceerbare fluorescerend eiwit expressie en weefsel specifieke etiketteringsvoorschriften, maakt het mogelijk om informatie over genetische manipulatie effecten op de totale cel verdubbelingstijd, celgrootte te verkrijgen en om precieze timing van de fasen van de celcyclus bepalen in vivo 9 , 11. Maar deze methode is tot nu toe vertrouwd op het gebruik van de cel permeabele Hoechst 33342 DNA-intercalerende kleurstof vlekken en kwantificeren van DNA in levende cellen, die alleen gebruikers cytometers stromen met een UV laser kan opwindende Hoechst kleurstof. Deze zijn over het algemeen alleen te vinden in sorteerders (dwz BD FACS Vantage, BD FACSAria) of dure multicolor stationaire systemen (dwz BD LSR), meestal die steun door institutionele stroming kernfaciliteiten.
We hebben het Hoechst-gebaseerd protocol gewijzigd om een nieuwe live-cell DNA kleurstof van Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet gebruiken. Deze kleurstof is compatibel met een violet 405 nm laser, vaker voor bij kleinere stationaire analysers en verkrijgbaar in de kleine zelfstandige tafelmodel analyzer, de Attune Acoustic Scherpstellen Cytometer. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor celcyclus analyse die kan worden gekoppeld met celtype, celgrootte, het aantal cellen en lineage analyse verschillende Drosophila weefsels in verschillende ontwikkelingsfasen gebruik DyeCycle Violet en Attune. Dit protocol breidt het aantal cytometers geschikt voor een dergelijke analyse Drosophila weefsels en geeft voorbeelden van hoe dit soort levende celcyclus analyse kan worden aangepast voor andere soorten weefsels en ontwikkelingsstadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol maakt voor de analyse van celcyclus, relatieve celgrootte en relatieve aantal cellen in levende Drosophila weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia. Bij deze analyse wordt gekoppeld aan cel-type-specifieke fluorescente eiwit expressie of lineage tracing, kan gedetailleerde informatie worden verkregen over cellulaire reacties op discrete celcyclus of groei van verstoringen. Als proof of principle, we verstoorde rust in het popstadium fly hersenen met het uitspreken van G1-S celcy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Aida de la Cruz voor het ontwikkelen en onderwijzen van het oorspronkelijke protocol waarop deze versie is gebaseerd 10. Werk in de Buttitta Lab wordt ondersteund door NIH subsidie GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
