Ex utero Elektroporation og Whole halvkugle Eksplantater: A Simple eksperimentel metode til Studier af tidlig Cortical Development

Summary

Denne protokol beskriver en forbedret explant proces, der omfatter<em> Ex utero</em> Elektroporation, dissektion og kultur af hele hjernehalvdele fra den embryonale mus. Præparatet letter farmakologiske undersøgelser og analyser af genfunktion i den tidlige kortikale udvikling.

Abstract

Cortical udvikling rummer et komplekst samspil mellem neuroner og ikke-neuronale elementer, herunder precursorceller, blodkar, hjernehinderne og tilhørende ekstracellulære matrix. Fordi de tilvejebringer en passende organotypisk miljø, corticale skive eksplantater ofte til at undersøge de interaktioner, der styrer neuronal differentiering og udvikling. Selvom gavnlig, kan skive eksplantat model lider af ulemper, herunder afvigende cellulær laminering og migration. Her rapporterer vi en hel hjernehalvdel eksplantat for studier af tidlig kortikale udvikling, der er lettere at forberede end kortikale skiver og viser konsekvent organotypisk migration og laminering. I denne model system skal du gøre tidlig laminering og migrationsmønstre normalt for en periode på to dage in vitro, inklusive perioden for præplade opdeling, hvor potentielle kortikale lag seks former. Vi derefter udviklet en ex utero elektroporation (EUEP)fremgangsmåde, der opnår ~ 80% succes med at målrette GFP udtryk for neuroner udvikler sig i den dorsale mediale cortex.

Hele halvkugle eksplantat model gør tidlig cortical udvikling tilgængelig for elektroporering, farmakologisk intervention og levende billeddannende fremgangsmåder. Denne metode undgår overlevelse kirurgi kræves af in utero elektroporation (IUEP) tilgange og samtidig forbedre både transfektion og areal målretning konsistens. Denne metode vil lette eksperimentelle studier af neuronal proliferation, migration og differentiering.

Introduction

De pattedyr cerebral cortex former gennem den samordnede proliferation, migration og differentiering af successivt genererede neuroner. Hver neuron fødes i den ventrikulære zone (VZ) og migrerer fra VZ i den mellemliggende zone (IZ) og danner den kortikale plade (CP) ^1. Når de passerer gennem forskellige kortikale områder, de vandrende neuroner viser flere former for migration ^2,3, der afhænger af det ekstracellulære miljø og andre cellulære bestanddele (fx radial glia) i udviklende væv. Corticale neuroner derefter standse migration i toppen af den formgivende kortikale plade i de sammenfaldende processer neuronal migration anholdelse og dendritogenesis ^4.

Cortical udvikling initieres mellem embryonale dag 11-13 (E11-13) ⁵ gennem etablering af det oprindelige netformige lag ⁶ eller præplade (PP), et lag af pioner neuroner, der ligger over VZ. Prospectivelag 6 kortikale neuroner (dvs. det første kortikale neuroner født i VZ) derefter orientere deres somata i en stereotyp mønster og smelter sammen til en særskilt lag i PP ^7. Disse begivenheder opdele præplade i en overfladisk marginal (fremtidige kortikale lag 1) og en dyb zone, hvor sidstnævnte består af subplate celler (forbigående kortikal lag 7). Denne proces, der kaldes præplade opdeling, er en grundlæggende begivenhed i den fremtidige vækst i hjernebarken ^8.

Mange genetiske mutationer er blevet identificeret som forstyrrer forskellige aspekter af cortical udvikling ^9. Cortical udvikling kan også blive negativt påvirket af udsættelse for indtagne toksiner, såsom kokain ¹⁰ og alkohol ^11. Fordi corticale misdannelser, der opstår under udvikling er sandsynlige bidragydere til neurologiske lidelser (f.eks autisme, skizofreni), empiriske undersøgelser af perturbationer til kortikale udvikling er iboendely vigtig. Det er derfor af stor betydning at etablere metoder til at studere kortikale udvikling, der giver hurtige analyser af genetiske eller toksin virkninger, men som også bevare de mulige interaktioner mellem differentiere neuroner, andre celletyper og ekstracellulær matrix (ECM) i løbet af denne tidlige periode af hjernens udvikling ¹² .

Skær eksplantater ¹³ har givet et sådant system, og er ofte blevet brugt til at analysere cortical neuron udvikling ^14-16. Imidlertid kan skive assays lider af den ulempe, at neuronal migration og laminering kan være unormal ¹⁷ muligvis på grund af beskadigelse af meningeal celler, der omgiver den udviklende hjerne og forankre radial glia scaffold. Som radiale glial fibre er en vigtig substrat for cortical neuron migrering ¹⁸ afbrydelse af den basale lamina ved skæring kan lokalt forstyrrer radial glia arkitektur og føre til ændret kortikale migration. Desuden SLIced overflader af eksplantater giver en region af døde celler, der kan ændre den normale sammensætning af ECM i disse områder.

Nyere tilgange har fokuseret deres analyse på celler placeret dybt i den skive, der er omgivet af behørige sunde celletyper og ECM. Men i nogle tilfælde kan disse nyere fremgangsmåder kan kræve, at den oprindelige tykke dyrkede skive være cryo-snit eller paraffin-snit efter fiksering, således at den relativt normale indre skive gøres tilgængelig til analyse ^19-21. Både den oprindelige vibratome sectioning til fremstilling af levende skiver til kultur samt den efterfølgende cryosectioning af faste skiver til analyse kræver omhu og indsats for disse assays til at arbejde.

At give en enkel, komplementær tilgang til studier af tidlig kortikale udvikling, har vi ændret en eksisterende skive tilgange ¹³ lette undersøgelser af tidlig kortikale udvikling. Vi har udviklet en whole halvkugle eksplantat model ligner eksisterende E14 hel halvkugle model, der involverede rystende kulturer ved 65 omdrejninger i minuttet og tilladt organotypisk vækst i 16-18 timer ^22,23. I vores fremgangsmåde, er hele halvkugle eksplantater anbragt på semipermeabel membran ¹³ med en høj oxygen-kultur atmosphere ^21,24 at udvide organotypisk kortikale vækst i 48 timer. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for konsekvent elektroporering for at udvikle corticale neuroner. Embryonerne udtages fra livmoderen og elektroporeret at introducere plasmid-DNA og telencephalon derpå dissekeret. Hver halvkugle isoleres og anbringes mediale side nedad på en collagen-coated filter. Eksplantatet dyrkes derefter i et tidsrum på 48 timer, et tidsrum, som omfatter præplade opsplitning ^8. I løbet af dyrkningsperioden, udvikler L6-neuroner fra precursor til differentieret neuron ²⁵ korrekt placeret i den korticale plade. I hele denne periode udviklingslandeneneuron er omgivet af en passende ECM-og celletyper, som vil konfrontere den tilsvarende celle in vivo. Dette system har allerede vist sig værdifulde i at decifrere de cellulære begivenheder, der ligger til grund for ethanol toksicitet ^26, lag 6 dannelse og præplade opdeling ^7,25.

Protocol

1. Ex utero elektroporeringer med Green Fluorescent Protein Expression Plasmid Plasmid-DNA injektionsopløsninger fremstilles med CAG-EGFP DNA 27 fortyndet til den endelige bearbejdning koncentration på 0,33 mg / ml i ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps anvendes til at oprense plasmid fra transformerede bakterier. Fast green farvestof på ~ 0,02% (vægt / volumen endelig) sættes til DNA-opløsningen som en injektion sporstof. For at forberede det kirurgiske område,…

Representative Results

Den embryonale gnaver cortex udviser en tværgående neurogenetic gradient hele den udviklingsmæssige periode, således at lateral neocortex er cirka 1 dag mere moden end dorsale mediale neocortex 28. Hovedparten af laget 6 neuroner dermed kan (dvs. udviser deres endelige S-fase) på E12 i lateral cortex (også kaldet Felt 40 5) og på E13 i den dorsale mediale cortex (også kaldet Felt 1 5). Præplade opdeling begynder cirka 1 dag efter Layer 6 neuron generation, og dermed er …

Discussion

Vi har forbedret og evalueret en eksperimentel model – hele halvkugle eksplantater – til undersøgelse af tidlige kortikale udvikling (E13-E15). Modellen har vist sig nyttig til analyse af migrering og differentiering af excitatoriske neuroner slægt, der udgør laget 6 i den cerebrale cortex ^25,37. De vigtigste fordele ved systemet er 1) organotypisk vækst for 2 DIV, 2) enkel tilberedning, og 3) eksperimentelle adgang til neuroner for elektroporation, farmakologisk manipulation og billedbehandling i løbet …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments (optional)
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Culture insert collagen coated	Costar	3492
Bovine skin gelatin	Sigma	G9382
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Bovine Serum Albumin	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Tweezer electrodes 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubator	Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton syringe (5 uL)	Hamilton	87930
Hamilton syringe needle	Hamilton	7803-04	Specify 1″ and style 4
Dumont #5 Forceps	FST	11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm	FST	14058-09