Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica

Abstract

Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal.

El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.

Introduction

Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) 1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración 2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación cortical en los procesos coincidentes de detención migración neuronal y 4 dendritogenesis.

Desarrollo cortical se inicia entre días embrionarias 11-13 (E11-13) 5 mediante el establecimiento de la capa plexiforme primordial 6 o la presiembra (PP), una capa de neuronas pioneras que recubre el VZ. FuturoCapa 6 neuronas corticales (es decir, las neuronas corticales primero nacido en el VZ) y luego orientar su Somata en un patrón estereotipado y se unen en una capa distinta en el PP 7. Estos eventos dividir la presiembra en un superficial marginal (futura capa cortical 1) y una zona profunda, el segundo compuesto de células subplaca (capa cortical transitoria 7). Este proceso, denominado fraccionamiento presiembra, es un acontecimiento fundamental en el crecimiento futuro de la corteza cerebral 8.

Muchas mutaciones genéticas se han identificado que interrumpir diversos aspectos del desarrollo cortical 9. Desarrollo cortical también pueden sufrir efectos negativos por la exposición a las toxinas ingeridas como la cocaína y el alcohol 10 11. Debido a las malformaciones corticales que surgen durante el desarrollo probablemente contribuyen a los trastornos neurológicos (por ejemplo, el autismo, la esquizofrenia), las investigaciones empíricas de las perturbaciones del desarrollo cortical son inherentesmente importante. Por tanto, es de gran importancia para establecer enfoques para estudiar el desarrollo cortical que permiten ensayos rápidos de los efectos genéticos o toxina, pero que también preservar las posibles interacciones entre las neuronas diferenciadoras, otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) durante este período temprano del desarrollo del cerebro 12 .

Explantes rebanada 13 han proporcionado un sistema y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo del ensayo neurona cortical 14-16. Sin embargo, los ensayos de rebanada puede adolecen del inconveniente de que la migración neuronal y la laminación puede ser anormal 17 posiblemente debido al daño a las células de las meninges que rodean el cerebro en desarrollo y el anclaje radial glial andamiaje. Como las fibras gliales radiales son un importante sustrato para la migración cortical neuronal 18 disrupción de la membrana basal por corte local puede alterar la arquitectura glial radial y causar la migración cortical alterada. Además el sliced superficies de explantes proporciona una región de células muertas que pueden alterar la composición normal de la ECM en estas áreas.

Los enfoques más recientes se han centrado su análisis en células localizadas profundamente en el sector que están rodeados de apropiados tipos de células sanas y ECM. Sin embargo, en algunos casos, estos nuevos enfoques pueden exigir que el original rebanada gruesa cultivadas ser crio-seccionado o seccionado en parafina después de la fijación de manera que el interior relativamente normal de la rebanada está disponible para el análisis 19-21. Tanto el vibratome original de seccionamiento para preparar las rodajas en vivo para el cultivo, así como la posterior de las rebanadas cryosectioning fijos para el análisis requieren un cuidado y esfuerzo para estos ensayos a trabajar.

Proporcionar un enfoque simple y complementaria para los estudios del desarrollo cortical temprano, hemos modificado una rebanada enfoques existentes 13 para facilitar los estudios del desarrollo cortical temprano. Hemos desarrollado un whhemisferio ole explante similar a un modelo existente E14 hemisferio que participan cultivos con agitación a 65 revoluciones por minuto y el crecimiento organotípico permitido para 16-18 horas 22,23 modelo. En nuestro enfoque, los explantes enteros hemisferio se colocan en la membrana semipermeable 13 con en una atmósfera de oxígeno alta cultura 21,24 para extender el crecimiento cortical organotípicos durante 48 horas. Este enfoque también permite la electroporación coherente de desarrollo de las neuronas corticales. Los embriones se extrae del útero y electroporación para introducir ADN plásmido y el telencéfalo es diseccionado a continuación. Cada hemisferio se aísla y se colocan lado medial hacia abajo sobre un filtro revestido con colágeno. El explante se cultivan entonces durante un período de 48 horas, un periodo que abarca dividir la presiembra 8. Durante el período de cultivo, L6 neuronas se desarrollan a partir de precursor a diferenciarse neurona 25, en posición correcta dentro de la placa cortical. A lo largo de este período, el desarrolloneurona está rodeado por el ECM apropiada y tipos de células que se enfrentaría la celda correspondiente en vivo. Este sistema ya ha demostrado su valía en el desciframiento de los eventos celulares que subyacen a la toxicidad del etanol 26, capa 6 y formación presiembra división 7,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido

  1. Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN 27 diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH 2 O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección.
  2. Para preparar el área quirúrgica, rocíe mesa de trabajo y la etapa microscopio de disección con una solución de etanol al 70% y secar. Rocíe tijeras y pinzas quirúrgicas, con 70% de etanol antes de la disección y seque.
  3. Temporizadas embarazadas suizos / Webster presas son sacrificados en E13 por transferencia a una cámara llena de CO 2 de un cilindro presurizado y la presa se ​​monitorea hasta que todo movimiento haya cesado por lo menos durante 1 min. Después del sacrificio por inhalación de CO 2, los embriones se extrae del útero y se colocó enuna placa de Petri de 10 cm de hielo frío que contiene solución salina equilibrada de Hanks (HBSS).
  4. Diseccionar cuidadosamente cada embrión a partir de las membranas que rodean extraembryonic y mantenerse en hielo-frío HBSS.
  5. Transferir cada embrión individual a un segundo 10 cm placa de Petri que contiene HBSS fría. Usar una jeringa de Hamilton para inyectar 2-3 l de la mezcla de ADN verde rápido en el ventrículo del hemisferio cerebral izquierdo, teniendo cuidado de inyectar en una zona cortical espacialmente separada de la zona cortical para el análisis futuro.
  6. Para electroporar, mantenga el embrión suavemente con fórceps y ligeramente colocar la pala del electrodo positivo pinza en la línea media dorsal de la cabeza y colocar suavemente la pala negativo debajo de la barbilla embrión. Electroporaciones se consiguen con un electroporador BTX830 programado para entregar cinco pulsos de 30 V de 50 ms de duración, separadas por intervalos de 950 mseg. Estos ajustes son para el modelo BTX830. Otros sistemas pueden ser utilizados de acuerdo con INSTRUCCIO fabricantens.

2. Todo el hemisferio Preparación del explante

  1. Después de la electroporación de los embriones se colocan de nuevo en hielo-frío HBSS. El cerebro es removido con dos pinzas de joyero º 5 para quitar la piel y el cráneo cartilaginoso de la cabeza del embrión. Una pinza se desliza entonces debajo del cerebro para eliminar el cerebro intacto del cráneo. El hemisferio electroporated (izquierda) se diseca lejos del cerebro y apegado a mediados de tejido cerebral se elimina. Durante todo el procedimiento de disección cuidado se toma para no dañar las meninges que recubren el hemisferio cortical izquierdo.
  2. Una vez diseccionado cada embrión se transfiere en HBSS utilizando una pipeta con un corte de punta de pipeta 1 ml. El hemisferio está expulsarlo lentamente hacia una inserción de colágeno cultura revestido. Hasta seis explantes hemisferio están dispuestas lado medial hacia abajo en cada inserción de 24 mm. Una vez dispuestas, HBSS en exceso se elimina de la pieza de inserción y la pieza de inserción se coloca a continuación en uno 35 mm pocillo de una placa de 6 pocillos. El pozo contiene exactly 2,7 ​​ml de medios de comunicación: DMEM-F12 medio que contenía Glutamax y suplementado con 2% de B-27, 1% G5 y 1% de penicilina-Strep. Unas pocas gotas de los medios de comunicación del bien puede ser una pipeta en la parte superior de cada explante, pero no añadir medios de comunicación por encima de la original de 2,7 ml por pocillo.
  3. Una vez que los explantes han sido colocados sobre filtros de colágeno de la placa de 6 pocillos que contiene los explantes se coloca en un Billups Rothenberg (BR) de la cámara (que también contiene un plato de humidificación de agua). Un 95% / 5% de oxígeno / CO 2 mezcla de gases se infunde en la cámara durante al menos 1 min antes de sellar el cierre de cámara y desconectar el 95% / 5% de oxígeno / CO 2 tubo de suministro de gas. La cámara de BR se coloca entonces en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido para el resto del período de cultivo, 1-2 DIV.

3. La fijación del tejido de explante para histología

  1. En una campana de humos preparar la solución de fijación Pagano por primera solubilizante 8 g de paraformaldehido en 100 ml de precalentado (~ 80 & deg; C) ddH 2 O. Añadir 1-3 gotas concentradas de NaOH para promover la solubilización y revuelva suavemente. Una vez solubilizado mezclar la solución de paraformaldehído al 8% 1:1 con una solución que es 500 mM de sacarosa, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl, para una concentración final de 4% de paraformaldehído en 250 mM de Hepes 50 mM de sacarosa , 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Para solucionar los explantes calentar la solución de arreglo Pagano a 37 ° C. Quite rápidamente la mayoría de los medios de comunicación DMEM/F12 de cada pocillo de cultivo y añadir 5 ml de Fix Pagano a cada pocillo de explantes. Asegúrese de cubrir completamente cada explante en fijo. Fijar durante 1 hora a RT. No retire explantes de filtro antes de 1 hora de la fijación.
  3. Después de la fijación eliminar la solución de arreglo Pagano y reemplazar con solución Pagano sin fijar (250 mM de sacarosa 50 mM Hepes, 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Añadir unas gotas de azida de sodio al 10% y se almacena a 4 º C hasta su incorporación.

4. Incorporación y Sectioning para histología

  1. Preparar una solución de piel de ternero 10% de gelatina por solubilización de 10 g de gelatina de piel de ternera en 100 ml de agua caliente (55-60 ° C). Coloque solución de gelatina en un plato caliente ajustado a 60 ° C y agitar periódicamente hasta solubilizado.
  2. Vierta aproximadamente 10 ml de la solución de gelatina al 10% en la parte inferior de una placa de Petri de 10 cm y 30 min para permitir que solidifique. Esto formará un "pad" para incorporar los explantes. Estas pastillas pueden ser preparadas de antemano días y se almacenó a 4 ° C. Use una regla para dibujar una cuadrícula en la parte inferior de la placa de Petri y transferir los explantes individuales en cada cuadro de la cuadrícula. Eliminar residual solución Pagano y usando una pipeta, cubrir cada explante con solución caliente 10% de gelatina y dejar que se solidifique. Reanudar la adición lenta de la solución de gelatina hasta que cada explante está completamente rodeada por gelatina, teniendo cuidado de no fundir la almohadilla por la adición de demasiado caliente gelatina a la vez. Permita que la gelatina se endurezca durante aproximadamente 1 hora. Una vez endurecido el indiexplantes UAL puede ser cortada en pequeños bloques de gelatina. Los bloques se después de la fijada en Pagano fijar durante 24-48 horas antes de seccionar con un vibrátomo.
  3. Los explantes en bloques de gelatina se coloca bulbo olfatorio y seccionada en el plano coronal a 100 m de espesor. Las secciones se recogen y almacenan en PBS + azida sódica al 0,1% a 4 º C hasta su procesamiento inmunohistoquímico.
  4. Detección inmunohistoquímica se realiza mediante la transferencia de las secciones en una placa de 24 pocillos (2-3 secciones por pocillo). Primer bloque no específica de unión del anticuerpo mediante la adición de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 y 2% de BSA) a cada pocillo, se incuba 1 hora con agitación suave. El anticuerpo primario apropiado es entonces diluido en PBST + B y 0,4 ml por pocillo se añaden para la incubación durante la noche a RT. La primaria se lavó con 3X lavados de PBS durante al menos 10 min cada uno. El anticuerpo secundario y 2 g / ml Hoechst 33342 tinción nuclear se diluyen a continuación en PBST + B y las muestras se incubaron durante 2 horas a RTcon agitación suave. Tres lavados con PBS (10 min cada una) se llevan a cabo y, a continuación, las secciones se montaron sobre portaobjetos utilizando un 90% de glicerol 50 mM Tris, pH 7,4, los medios de montaje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex 28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 5) y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 5). Dividir la presiembra se inicia aproximadamente 1 día después de la capa 6 de generación de neuronas y de este modo se inicia en la corteza lateral en E13 y la corteza dorsal en E14. Para estudiar la división presiembra y el inicio del desarrollo cortical, se modificó un ensayo de explante rebanada 21,24 enteros tales que hemisferios cerebrales se cultivaron típicamente desde E13 a E15 (Figura 1).

Hemos probado la viabilidad de la técnica de explante cortical examinando el crecimiento de los explantes hemisferio entero derived de Tg (Eomes :: eGFP) GSAT ratones (Figura 2). Esta cepa de ratón contiene un transgén que los informes de las neuronas inmaduras del linaje de excitación cortical 7,29,30. Explantes enteros hemisferio corticales se prepararon a E13, en un punto de tiempo antes de la presiembra división en el neocórtex dorsal (Figura 2A). Explantes corticales de la misma camada eran gota fijado secuencialmente durante un período de 2 DIV y se procesaron para el análisis histológico posterior. En el punto de análisis de tiempo inicial (DIV 0), la división de presiembra todavía no ha ocurrido en el Campo 1 (neocortex dorsal; Figuras 2A, 2E). Para el 1 DIV del PP es evidente (Figuras 2B, 2C, 2F, 2G), y continúa creciendo hasta 2 DIV (Figuras 2D, 2H). Así, los explantes hemisferio cultivaron inicialmente en E13 apoyo durante dos días la maduración de la corteza cerebral y captura dividir la presiembra en el neocórtex dorsal.

Para confirmar normaal desarrollo histológico en el neocórtex dorsal, se inmunotiñeron 2 explantes div para proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), un componente de la matriz extracelular que es también un marcador establecido de la PP y sus derivados y el MZ SP 8,31,32. La inmunotinción para CSPGs revela dos bandas de CSPG inmunoreactividad en la corteza dorsal indicando la división apropiada del PP en MZ y SP durante el período de cultivo in vitro (Figuras 3A 3C-). El PP se divide por L6 neuronas corticales que se sabe que expresan los factores de transcripción y Ctip2 7,33,34 Tbr1. El patrón de inmunotinción de estos marcadores (Figuras 3D-3F, 3G-I, respectivamente) confirma la expresión apropiada de estos factores de transcripción en el CP recién formado. En conjunto, estos análisis confirman organotípico desarrollo cortical temprano en los explantes hemisferio.

En el útero electroporaciones se han utilizado ampliamentepara el ensayo de la función de genes de células autónomas en el desarrollo de la corteza 35. Por lo tanto, si la prueba electroporación con éxito podría transfectar neuronas en el modelo de explante hemisferio entero. El ventrículo izquierdo del intactas E13 embriones fueron inyectados con 0,33 mg / ml CAG-GFP plásmido y se electroporaron (ver Métodos) para introducir el plásmido de ADN en los precursores neuronales que recubren el ventrículo lateral (Figura 1A). Después de 2 DIV los explantes se retiraron fijo y se seccionaron para el análisis histológico. En este punto de tiempo, las células que expresan GFP se observaron en todas las zonas corticales a través de la pared cerebral (Figuras 4A-4C). Expresión de GFP se observó a partir de precursores neuronales en el VZ mientras que las células que expresan GFP intensas fueron observadas en el IZ y CP. Es importante destacar que numerosas neuronas GFP + se observaron en la parte superior de la CP de conformación con dendritas y axones emergentes. Las células han formado una capa discreta en la interfaz entre el CP y indicatin MZg detención de migración adecuada y laminación (Figuras 4A-4C, flechas). Las dendritas se extendió hasta el MZ mientras que los axones corticofugal extenderse por debajo del PP y en la IZ (Figuras 4A-4C y 5 Véase también S1 Suplementarios de película). Debajo de las células que se diferencian son GFP + células en diferentes estados de madurez, incluyendo las neuronas con una morfología bipolar, yuxtapuesta a las fibras gliales radiales y debajo de ellos, las neuronas multipolares en el IZ (Figuras 4D-4F). Además, las dendritas se observan extiende en el MZ donde la proteína Reelin ECM es apropiadamente immunolocalized (Figuras 4G-4I). Las condiciones de electroporación y explante así permitir el desarrollo normal de las neuronas corticales a través de las etapas del precursor a la migración de una neurona a diferenciar inmaduro.

En el momento de electroporación (E13) 100% de las neuronas producidas por los VZ neocorticales dorsales son L6 neuronas, las neuronasque divide al PP 5. Electroporación con éxito requiere que las construcciones se introdujeron en neuronas durante la hr 6 inmediatamente antes de, o durante, 36 de la fase M del ciclo celular. Así, se espera que la primera postmitotic, GFP + neuronas siguientes E13 electroporación en la corteza dorsal (campo 1) se debe rellenar el CP de conformación. Tales neuronas se observó (Figura 4) que indica que el protocolo fiable puede orientar L6 neuronas corticales para estudios de su migración y maduración.

Para estimar la "tasa de éxito" del procedimiento de electroporación / explante se analizó una investigación en curso en nuestro laboratorio. En el curso de este estudio, 21 litros de explantes se han preparado, con un total de 248 embriones se sometieron a electroporación (como se describió anteriormente) con CAG-GFP, y un explante hemisferio individual de cada embrión fue preparado. De los originales 248 explantes, 195 (79%) se consideraron adecuados para formación de imágenes y análisis. Alrededor de la mitad de los 53explantes que no pudieron ser analizados dejado de expresar GFP o tenía mal orientada por la expresión de GFP. Las pérdidas restantes se explica por el crecimiento dismórfico debido a explantar desprendimiento del filtro de cultivo, o problemas asociados con el procesamiento histológico. Este porcentaje de éxito de aproximadamente el 80% (Figura 5) ha hecho que el sistema de explante adecuado para estudios farmacológicos 26, así como el análisis de mutaciones recesivas 7 que afectan adversamente al desarrollo cortical temprana.

Figura 1
Figura 1. Todo el procedimiento de explante hemisferio con la electroporación ex utero. A) E13 embriones de ratón se inyecta con una solución de ADN plasmídico y electroporación. Los cerebros se diseca y secciona sagital. El electroporatedhemisferio se colocan lado medial hacia abajo en un filtro revestido de colágeno y se cultivaron durante 2 DIV. Los hemisferios continuación, se pueden obtener imágenes en vivo o fijado para la histología y análisis de imágenes subsiguiente. B) Una foto de 10 explantes colocados en tres filtros en un seis plato de cultivo de tejidos. C) El plato de seis pocillos con explantes se coloca en un ambiente de oxígeno elevado (95% O 2/5% CO 2) dentro de una cámara Billups-Rothenberg Incubadora, que se coloca luego en un estándar de 37 ° C incubadora cultivo tisular.

Figura 2
Figura 2. Crecimiento organotípico de la placa cortical en explantes hemisferio derivados de una sola camada de Eomes :: embriones eGFP. A, E) una sección coronal de un cerebro menú fija al comienzo del culto ure período (O DIV). Tenga en cuenta que el PP está presente, pero que aún no ha sido CP para formar. La señal verde es producido por la expresión de GFP en inmaduros neuronas excitadoras y el azul es el reactivo de Hoechst que etiqueta el núcleo de todas las células. B, F). Crecimiento CP, indicada por líneas de trazos, se observa por 0,5 DIV y se incrementa en 1 DIV (C y G) y 2 DIV (paneles D y H). Tenga en cuenta el aumento del espesor de la célula que expresan GFP dominio en AD paneles, lo que indica la proliferación y la diferenciación del linaje neurona excitatoria en el explante. Las barras de escala son 500 micras (panel A) y 50 micras (panel H). Abreviaturas: CP, placa cortical, IZ, Zona Intermedia, MZ, Zona Marginal, SP, sobre placa, VZ, zona ventricular.

/ 50271/50271fig3.jpg "/>
Figura 3. Dividir la presiembra en explantes hemisferio entero. AC) proteoglicano sulfato de condroitina (CSPG) inmunotinción ilustra la división (separación) del PP en el MZ y DF SP.) Expresión de la Ctip2 factor de transcripción en el CP recién formado. GI) Expresión de la transcripción Tbr1 factor en el CP recién formado. Las barras de escala son 50 m en los paneles C, F, I.

Figura 4
Figura 4. GFP expresión en explantes hemisferio después de la electroporación in utero E13 ex. AC) GFP expresión después de 2 DIV. Obsérvese la capa de neuronas corticales que forman en la parte superior de la CP (flechas). DF) Nestin (rojo) immunoreactivdad en una sección de un explante hemisferio entero. GH) Reelin (rojo) inmunoreactividad en una sección derivado de un explante hemisferio entero. Las barras de escala en los paneles C, F, y son de 50 micras.

Figura 5
Figura 5. La variabilidad en la orientación electroporaciones ex útero para corteza medial dorsal (campo 1). Once embriones de una sola camada se sometieron a electroporación con la construcción de expresión CAG-GFP (0,33 mg / ml) y se cultivaron como explantes hemisferio entero. AI) nueve de los once explantes mostraron expresión de GFP en la corteza medial dorsal. Aunque la expresión de GFP varía entre explantes, en cada explante GFP se detecta en las tres zonas corticales (es decir, VZ, IZ y CP). Barra de escala es de 50 micras en el panel A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental - explantes enteros hemisferio - para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral 25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la manipulación farmacológica y de imagen durante este período inicial, crítico del desarrollo cerebral. Hemos utilizado el sistema para documentar sutiles diferencias en la morfología, la orientación y el crecimiento dendrítico de la capa 6 neuronas corticales 7,38 durante el período de dividir la presiembra.

Las neuronas excitadoras que pueblan la capa 6 se compone en gran parte de las neuronas de proyección corticotalámicas que proporcionen información recíproca al tálamo dorsal 39,40 41. Aunque estas neuronas son fisiológicamente especializada, el proceso de generación, migración y maduración de las neuronas capa 6 comparte características básicas con todas las neuronas excitadoras en las capas 2-6 de la corteza. En concreto, todas las neuronas corticales excitatorios se generan en el VZ telencephalic dorsal, migran a través de la IZ como neuronas multipolares, y diferenciar dentro de la CP 7. La maduración de las neuronas excitatorias corticales es accionado por un conjunto básico de factores de transcripción expresados ​​de forma secuencial: Pax6, Tbr2, y 29 Tbr1. Esta secuencia es compartida por todas las neuronas excitadoras en las capas 2-6 y 42 se confirmó la expresión apropiada de Tbr1 en el CP recién formado (Figuras 3G-3I). La utilización de este método para investigar el desarrollo de la capa 6 neuronas corticales debería proporcionar información esencial en el desarrollo de neuRon, que constituyen todas las capas corticales.

Explantes enteros hemisferio complementar los enfoques existentes para estudios de desarrollo neuronal cortical. Estudios previos han empleado un enfoque completamente E14 explante hemisferio para estudiar el desarrollo cortical durante 1 DIV 22,23. Hemos acoplado explantes enteros hemisferio con la electroporación ex utero para investigar 2 días del desarrollo cortical durante el período de formación de L6 y dividir la presiembra. A diferencia de en el útero en electroporaciones E13, la tasa de éxito de electroporaciones ex utero seguido por explante hemisferio entero es mayor: en nuestras manos lograr el éxito ~ 80% en la selección de electroporación para el telencéfalo dorsal. Además, en el útero electroporaciones requerir una cirugía supervivencia y requieren un esfuerzo mucho más técnico que el enfoque útero hemisferio ex. Por último, en los estudios in utero no son fácilmente susceptibles a farmacológica precisamanipulaciones y enfoques de formación de imágenes. El control preciso temporal en el suministro o la activación de drogas y agentes moleculares (vectores de expresión, construcciones de silenciamiento, etc) a concentraciones definidas se proporciona con los explantes hemisferio entero, pero es más difícil de lograr en el útero. Vivir monitorización óptica de los efectos resultantes de dichas manipulaciones, con una resolución espacial en el rango de micras, es fácilmente disponible con EUEP, pero no IUEP. Tal precisión es probable que aumente sustancialmente el poder interpretativo de los datos obtenidos a partir de experimentos que involucran el desarrollo cortical y la función. Así, para los estudios de explantes iniciales del desarrollo cortical del hemisferio entero poseen distintas ventajas experimentales sobre el enfoque en el útero. En este momento, sin embargo, para los estudios de las neuronas corticales de la capa superior y experimentos que requieren la recopilación de datos> 48 hr, explantes rebanada y en enfoques in utero siendo preferible.

Hay varios requisitos críticos para el éxito de la técnica de explante hemisferio entero. En primer lugar, el crecimiento del explante es altamente sensible a la integridad mecánica de las meninges. El daño físico a las meninges (es decir, pinchazos o roturas) será como mínimo perturbar el desarrollo local de la corteza subyacente. En segundo lugar, el crecimiento del explante es sensible al volumen total de medios dentro del pocillo de cultivo: con medios demasiado los explantes se desengancha del filtro y desarrollar una arquitectura CP distorsionada; con medios muy poco y los explantes son propensos a deshidratarse y experimentan muerte celular excesiva . Por último, en los explantes técnica actual hemos documentado crecimiento cortical durante 2 DIV. Cuando a partir de E13 esta ventana de tiempo de desarrollo, a pesar de admitir muchas investigaciones valiosas, restringe el análisis a un período anterior a la sinaptogénesis y la comunicación neuronal canónica. Aunque las neuronas corticales en E14.5 ARNm que codifica para expresar muchas proteínas sinápticas (w.genepaint.org "target =" _blank "www.genepaint.org>), sinaptogénesis no comienza hasta ~ E15 en la corteza lateral, y esto sinaptogénesis se limita a la presiembra células en lugar de la capa 6 neuronas 43. Algunas de las preguntas críticas acerca de formación de la sinapsis cortical y la función son por lo tanto actualmente no direccionable con el sistema de explante hemisferio entero.

En la conclusión de la preparación del explante hemisferio entero puede utilizarse de forma fiable y consistente para investigar el desarrollo cortical temprano en modelos de ratón de heredables malformaciones cerebrales. La técnica es fácilmente adaptable a RNAi, shRNA, y otras manipulaciones moleculares y farmacológicos. El explante hemisferio también es adecuado para los estudios con la proteína recombinante aplicada, fármacos y toxinas ambientales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Acknowledgments

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones (NINDS NS066071) y el NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Los autores agradecen al Dr. Robert Quinn y el personal del Departamento de Recursos Animales de laboratorio para el cuidado de los animales. Damos las gracias a Judson Belmont para el apoyo técnico, Nicole Belletier de asistencia como miembro de Verano de Investigación de Pregrado (SURF). También agradecemos al Dr. David Cameron y edita los comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
  2. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
  3. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
  4. Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
  5. Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
  6. Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
  7. Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
  8. Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
  9. Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
  10. Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
  11. Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
  12. Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  14. O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
  15. Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
  16. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  17. Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  18. Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
  19. Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
  20. Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
  21. Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
  22. Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
  23. Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
  24. Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
  25. O'Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
  26. Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
  27. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
  28. Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
  29. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  30. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
  31. Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
  32. Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
  33. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
  34. McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
  35. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  36. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
  37. Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
  38. O'Dell, R., et al. Society for Neuroscience. , Washington D.C. (2011).
  39. Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
  40. Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
  41. Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
  42. Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
  43. Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).

Tags

Neurociencia Número 74 Genética Neurobiología Biología del Desarrollo Anatomía Fisiología Biología Molecular Biología Celular Bioingeniería Ingeniería de Tejidos la división de presiembra, dendritogenesis ensayo de la función de genes, GFP los explantes del hemisferio la expresión génica plásmido explante modelo de tejido cultivo celular cultivo de tejidos animal
<em>Ex utero</em> electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nichols, A. J., O'Dell, R. S.,… More

Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter