Ex utero Elektroporation och Hela Explantat Hemisphere: En enkel Experimentell metod för studier av tidig kortikal utveckling
Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad explantat förfarande som innebär<em> Ex utero</em> Elektroporering, dissekering och kultur av hela hjärnhalvorna från embryonala mus. Beredningen underlättar farmakologiska studier och analyser av gen funktion under tidig kortikal utveckling.
Abstract
Kortikal utveckling handlar komplexa interaktioner mellan nervceller och icke-neuronala element inklusive prekursorceller, blodkärl, hjärnhinnor och tillhörande extracellulär matrix. Eftersom de ger en lämplig organotypisk miljö, kortikala skiva explantaten ofta används för att undersöka interaktioner som styr neuronal differentiering och utveckling. Även välgörande, kan skivan explantat modell lider nackdelar inklusive avvikande cellulära laminering och migration. Här rapporterar vi ett helt cerebral-system halvklotet explantat för studier av tidig kortikal utveckling som är lättare att förbereda än kortikala skivor och visar konsekvent organotypisk migration och laminering. I detta modellsystem, tidig laminering och migrationsmönster fortsätta normalt för en period av två dagar in vitro, inräknat preplate delning, under vilken blivande kortikal lager sex former. Vi utvecklade då en ex utero elektroporering (EUEP)strategi som uppnår ~ 80% framgång i att rikta GFP uttryck för nervceller utvecklas i den dorsala mediala cortex.
Hela halvklotet explantat modellen gör tidig kortikal utveckling tillgänglig för elektroporering, farmakologisk behandling och levande metoder avbildning. Denna metod undviker överlevnad kirurgi krävs av i livmodern elektroporering (IUEP) tillvägagångssätt och samtidigt förbättra både transfektion och areal inriktning konsistens. Denna metod kommer att underlätta experimentella studier av neuronala tillväxt, migration och differentiering.
Introduction
De däggdjur hjärnbarken former genom samordnade tillväxt, migration och differentiering av successivt genererade neuroner. Varje neuron är född i den ventrikulära zonen (VZ) och migrerar från VZ in den mellanliggande zonen (IZ), som bildar den kortikala plattan (CP) 1. När de passerar genom olika kortikala områden, de migrerande nervceller uppvisar flera former av migration 2,3 som är beroende av den extracellulära miljön och andra cellulära element (t.ex. radial Glia) inom utveckling vävnaden. Kortikala neuroner arrestera sedan migration på toppen av formande kortikala plattan i de sammanfallande processer för neuronal migrering och gripande dendritogenesis 4.
Kortikal utveckling initieras mellan embryonala dagar 11-13 (E11-13) 5 genom etablering av ursprungliga plexiform lagret 6 eller preplate (PP), ett lager av pionjär nervceller som ligger över VZ. Blivandelager 6 kortikala neuroner (dvs. de första kortikala neuron födda i VZ) sedan inrikta sin somata i en stereotyp mönster och smälter samman till ett distinkt skikt i PP 7. Dessa händelser dela preplate i en ytlig marginell (framtida kortikal lager 1) och en djup zon, den senare består av plattmontering celler (övergående kortikal lager 7). Denna process, som kallas preplate delning, är en grundläggande händelse i framtida tillväxt av hjärnbarken 8.
Många genetiska mutationer har identifierats som stör olika aspekter av kortikal utveckling 9. Kortikal utveckling kan också påverkas negativt av exponering för intagna toxiner som kokain 10 och alkohol 11. Eftersom kortikala missbildningar som uppstår under utvecklingen är sannolikt bidrar till neurologiska sjukdomar (t.ex. autism, schizofreni), empiriska undersökningar av störningar till kortikalt utveckling är inneboendely viktigt. Det är därför av stor betydelse för att fastställa metoder för att studera kortikal utveckling som tillåter snabba analyser av genetiska eller toxin effekter men som också bevarar de möjliga interaktioner mellan differentiering nervceller, andra celltyper och extracellulär matrix (ECM) under denna tidiga period av hjärnans utveckling 12 .
Slice explantat 13 har tillhandahållit ett sådant system och har ofta använts för att analysera kortikal neuron utveckling 14-16. Emellertid kan slice analyser har den nackdelen att den neuronala migration och laminering kan vara onormal 17 möjligen på grund av skador på de meningeala celler som omger den växande hjärnan och förankra radiella gliaceller ställningen. Som radiella gliaceller fibrer är en viktig substrat för kortikal neuron migration 18 avbrott i basala lamina genom skärning kan lokalt störa radiell glia arkitektur och leda till förändrad kortikal migration. Dessutom SLICED ytor explantat tillhandahåller ett område av döda celler som kan ändra den normala sammansättningen av ECM i dessa områden.
Nyare försök har fokuserat sin analys på celler belägna djupt i segment som är omgivna av lämpliga friska celltyper och ECM. I vissa fall kan dessa nyare metoder kan kräva att den ursprungliga tjocka odlade skiva vara kryo-delad eller paraffin-delad efter fixering så att den relativt normal inre skivan görs tillgänglig för analys 19-21. Både den ursprungliga vibratome sektionering att förbereda levande segment för kultur samt den efterföljande cryosectioning fasta skivor för analys kräver vård och ansträngning för dessa analyser ska fungera.
För att ge en enkel, kompletterande strategi för studier av tidig kortikal utveckling har vi ändrat en befintlig skiva närmar 13 för att underlätta studier av tidig kortikal utveckling. Vi har utvecklat en whOle halvklotet explantat modell som liknar en befintlig E14 hela hemisfären modell som involverade skakar kulturer vid 65 varv per minut och får organotypisk tillväxt för 16-18 timmar 22,23. I vår metod, är hela hemisfären explantat placerades på semipermeabelt membran 13 med i en hög syre-kultur atmosfär 21,24 att sträcka organotypisk kortikal tillväxt under 48 timmar. Detta tillvägagångssätt möjliggör också konsekvent elektroporering utveckla kortikalneuroner. Embryona avlägsnas från livmodern och elektroporerades att introducera plasmid-DNA och telencefalon därefter dissekeras. Varje hemisfär isoleras och placeras mediala sidan nedåt på en kollagen-belagda filtret. Explantatet odlas sedan under en period av 48 timmar, en period som omfattar preplate uppdelning 8. Under kultur perioden L6 neuroner utvecklas från prekursor till differentierade neuron 25, rätt positionerad i kortikala plattan. Under hela denna period utvecklingsländernaneuron omges av lämplig ECM och celltyper som skulle möta motsvarande cell in vivo. Detta system har redan visat sig värdefulla i att dechiffrera de cellulära händelser som ligger till grund för etanol toxicitet 26, skikt 6 bildning och preplate dela 7,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har förbättrat och utvärderat en experimentell modell – hela halvklotet explantaten – för att studera tidiga kortikal utveckling (E13-E15). Modellen har visat sig användbar för analys av migration och differentiering av den excitatoriska neuron härstamning som utgör lagret 6 av hjärnbarken 25,37. De principiella fördelarna med systemet är 1) organotypisk tillväxt för 2 DIV 2) enkelhet i framställning, och 3) experimentell tillgång till neuroner för elektroporering, farmakologisk manipulatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes bidrag från NINDS (NS066071) och NIAAA. (P50AA017823) ECO. Författarna tackar Dr Robert Quinn och personalen på avdelningen av försöksdjur resurser för djurvård. Vi tackar Judson Belmont för teknisk support, Nicole Belletier för hjälp som en sommar Grundutbildning Research Fellow (SURF). Vi tackar också Dr David Cameron för kommentarer och ändringar på en tidigare version av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
