Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale
Summary
Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge<em> Ex utero</em> Elettroporazione, la dissezione e la cultura di interi emisferi cerebrali dal mouse embrionale. La preparazione facilita studi farmacologici e analisi della funzione del gene durante le prime fasi dello sviluppo corticale.
Abstract
Sviluppo corticale comporta complesse interazioni tra neuroni e non neuronali elementi, comprese le cellule precursori, i vasi sanguigni, le meningi e relativi matrice extracellulare. Perché offrire un ambiente appropriato organotipica, espianti fetta corticali sono spesso usati per studiare le interazioni che controllano la differenziazione neuronale e lo sviluppo. Anche se utile, il modello di espianto fetta possono soffrire di inconvenienti tra cui aberrante laminazione cellulare e la migrazione. Qui riportiamo un intero sistema cerebrale espianto emisfero per gli studi di primo sviluppo corticale che è più facile da preparare rispetto fettine corticali e spettacoli coerenti migrazione organotipica e laminazione. In questo sistema modello, laminazione precoce e modelli di migrazione procedere normalmente per un periodo di due giorni in vitro, compreso il periodo della scissione preplate, durante il quale prospettiva strato corticale sei forme. Abbiamo poi sviluppato un ex elettroporazione in utero (EUEP)approccio che ottiene un successo ~ 80% in termini di orientamento espressione GFP ai neuroni in via di sviluppo nella corteccia dorsale mediale.
L'intero modello di espianto emisfero corticale rende sviluppo precoce accessibili per l'elettroporazione, l'intervento farmacologico e approcci di imaging dal vivo. Questo metodo evita l'intervento chirurgico sopravvivenza richiesto in utero elettroporazione (IUEP) approcci, migliorando sia la trasfezione e areale coerenza targeting. Questo metodo faciliterà studi sperimentali neuronale proliferazione, migrazione e differenziazione.
Introduction
Le forme di mammifero attraverso la corteccia cerebrale concertata proliferazione, migrazione e differenziazione dei neuroni successivamente generati. Ogni neurone è nato nella zona ventricolare (VZ) e migra dal VZ nella zona intermedia (IZ), formando la piastra corticale (CP) 1. Come passano attraverso diversi domini corticali, i neuroni migrano visualizzare molteplici modalità di migrazione 2,3 che dipendono dall'ambiente extracellulare e altri elementi cellulari (es glia radiale) all'interno del tessuto di sviluppo. Neuroni corticali quindi arrestare migrazione in alto della piastra di formatura corticale nei processi coincidenti arresto migrazione neuronale e 4 dendritogenesis.
Sviluppo corticale è iniziata tra i giorni embrionali 11-13 (E11-13) 5 tramite la costituzione dello strato primordiale plessiforme 6 o preplate (PP), uno strato di neuroni pionieri che sovrasta il VZ. Potenzialestrato 6 neuroni corticali (cioè i neuroni corticali prima nati nel VZ) poi orientare la loro somata in un modello stereotipato e fondersi in uno strato distinto all'interno del PP 7. Questi eventi dividere il preplate in un superficiale marginale (futuro strato corticale 1) e una zona profonda, quest'ultimo composto da cellule a piastra (strato corticale transitoria 7). Questo processo, chiamato scissione preplate, è un evento fondamentale per la crescita futura della corteccia cerebrale 8.
Molte mutazioni genetiche sono state identificate che inficiano vari aspetti dello sviluppo corticale 9. Sviluppo corticale possono essere influenzate negativamente da esposizione a sostanze tossiche ingerite come la cocaina 10 e alcool 11. Perché malformazioni corticali che si presentano durante lo sviluppo sono tra i probabili disturbi neurologici (autismo es. schizofrenia), indagini empiriche delle perturbazioni allo sviluppo corticale sono inerentily importante. E 'quindi di notevole importanza per stabilire approcci per studiare lo sviluppo corticale che consentono analisi rapide di effetti genetici o tossina, ma che conserva anche le possibili interazioni tra i neuroni di differenziazione, altri tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) durante questo primo periodo di sviluppo del cervello 12 .
Espianti fetta 13 hanno fornito un tale sistema e sono stati ampiamente utilizzati per saggiare sviluppo corticale neuroni 14-16. Tuttavia, i saggi fetta possono soffrire l'inconveniente che la migrazione neuronale e laminazione può essere anormale 17 forse a causa di danni alle cellule meningee che circondano il cervello in via di sviluppo e ancorare il radiali gliali patibolo. Come le fibre radiali gliali sono un importante substrato per la migrazione dei neuroni corticali 18 interruzione della lamina basale mediante tranciatura può interrompere localmente radiale architettura gliali e portare a alterata migrazione corticale. Inoltre la slisuperfici ced di espianti fornisce una regione di cellule morte che possono alterare la normale composizione della ECM in queste aree.
Approcci più recenti hanno concentrato la loro analisi su cellule trova nel cuore della slice che sono circondati da adeguati tipi di cellule sane e ECM. Tuttavia, in alcuni casi, questi nuovi approcci possono richiedere che l'originale fetta spessa colta essere crio-sezionato o paraffina sezionata dopo fissazione in modo che l'interno relativamente normale della fetta è reso disponibile per l'analisi 19-21. Sia il vibratomo originale sezionamento per preparare le fette diretta cultura nonché la successiva criosezionamento fette fissi per analisi richiede cura e sforzo per questi saggi lavorare.
Per fornire un semplice, approccio complementare allo studio dei primi stadi dello sviluppo corticale, abbiamo modificato una fetta approcci esistenti da 13 a facilitare gli studi di primo sviluppo corticale. Abbiamo sviluppato un whole espianto emisfero modello simile a un modello esistente E14 emisfero che ha coinvolto le culture si stringono a 65 rotazioni al minuto e consentito la crescita organotipica per 16-18 ore 22,23. Nel nostro approccio, espianti emisfero interi sono posti sulla membrana semipermeabile 13 con in un'atmosfera di cultura ossigeno 21,24 estendere organotipica crescita corticale per 48 ore. Questo approccio consente inoltre di elettroporazione coerente di sviluppo neuroni corticali. Gli embrioni vengono rimossi dall'utero e elettroporate introdurre DNA plasmidico e telencefalo viene sezionato. Ogni emisfero è isolato e posizionato lato mediale su un collagene rivestita filtro. L'espianto viene poi coltivata per un periodo di 48 ore, un periodo che comprende splitting preplate 8. Durante il periodo di coltura, L6 neuroni sviluppano da precursore differenziato neurone 25, correttamente posizionata all'interno della piastra corticale. Durante questo periodo in via di svilupponeurone è circondato dalla ECM appropriata e tipi cellulari che confrontano la cella corrispondente in vivo. Questo sistema si è già dimostrato utile nel decifrare gli eventi cellulari che stanno alla base tossicità dell'etanolo 26 strato 6 formazione e preplate scissione 7,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo migliorato e valutato un modello sperimentale – espianti tutto l'emisfero – per lo studio delle prime fasi dello sviluppo corticale (E13-E15). Il modello si è dimostrato utile per l'analisi della migrazione e differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio che costituisce lo strato 6 della corteccia cerebrale 25,37. I principali vantaggi del sistema sono 1) la crescita organotipica per 2 DIV, 2) la semplicità di preparazione, e 3) accesso sperimentale alle neuroni per elettroporazione, ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NINDS (NS066071) e il NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Gli autori ringraziano il Dr. Robert Quinn e il personale del Dipartimento delle Risorse Animali di laboratorio per la cura degli animali. Ringraziamo Judson Belmont per il supporto tecnico, Nicole Belletier di assistenza, come Fellow Undergraduate Research Estate (SURF). Ringraziamo anche il dottor David Cameron per i commenti e le modifiche in una versione precedente del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
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