Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Summary

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui implique<em> Ex utero</em> Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l'embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

Abstract

Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu'ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d'explant tranche peuvent souffrir d'inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l'ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial.

Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l'électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d'imagerie en direct. Cette méthode permet d'éviter la chirurgie de survie nécessaire d'électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.

Introduction

Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) ^1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration ^2,3 qui dépendent de l'environnement extracellulaire et d'autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la plaque de formage corticale dans les processus d'arrêt coïncidant migration neuronale et ⁴ dendritogénèse.

Développement cortical est initiée entre embryonnaires jours 11-13 (E11-13) ⁵ à travers la couche de mise en place primordiale plexiforme ⁶ ou preplate (PP), une couche de neurones pionniers qui recouvre le VZ. Éventuelcouche 6 neurones corticaux (c'est à dire les premiers neurones corticaux nés dans le VZ) puis orienter leur corps cellulaire dans un modèle stéréotypé et se fondre en une couche distincte au sein du PP ^7. Ces événements diviser le preplate dans une superficielle marginale (future couche corticale 1) et une zone de profondeur, ce dernier composé de cellules sous-plaque (transitoire couche corticale 7). Ce processus, appelé le fractionnement preplate, est un événement fondamental dans la croissance future du cortex cérébral ^8.

De nombreuses mutations génétiques ont été identifiés qui perturbent les différents aspects du développement cortical ^9. Développement cortical peut également être affectée négativement par l'exposition à des toxines ingérées telles que la cocaïne et l'alcool ^{10 11.} Parce que des malformations corticales qui se posent au cours du développement sont probablement contribué à des troubles neurologiques (autisme, par exemple, la schizophrénie), les enquêtes empiriques de perturbations du développement cortical sont inhérentesment important. Il est donc d'une importance considérable pour établir des approches pour étudier le développement cortical qui permet des tests rapides d'effets génétiques ou de la toxine mais aussi de préserver les interactions possibles entre les neurones de différenciation, d'autres types cellulaires et la matrice extracellulaire (ECM) au cours de cette première période de ¹² le développement du cerveau .

Explants tranche ¹³ ont fourni un tel système et ont été largement utilisés pour analyser neurone développement cortical ^14-16. Toutefois, les essais de tranche peuvent souffrir de l'inconvénient que la migration neuronale et de stratification peut être anormale ¹⁷ probablement en raison de dommages aux cellules méningées qui entourent le cerveau en développement et l'ancrage du gliales radiales échafaud. Comme radiales fibres gliales sont un substrat important pour la migration des neurones corticaux ¹⁸ rupture de la membrane basale par tranchage peut perturber localement radiale l'architecture des cellules gliales et conduire à la migration corticale altérée. En outre, le sliced surfaces d'explants fournit une région de cellules mortes qui peuvent modifier la composition normale de l'ECM dans ces domaines.

Des approches plus récentes ont concentré leur analyse sur les cellules situées au fond de la tranche qui sont entourés par des types de cellules appropriées sains et ECM. Toutefois, dans certains cas, ces nouvelles approches peuvent exiger que l'original tranche épaisse culture cryo-être sectionné ou de la paraffine après fixation de section afin que l'intérieur relativement normal de la tranche est mis à disposition pour l'analyse de ^19-21. À la fois l'origine vibratome sectionnement pour préparer les tranches en direct pour la culture, ainsi que la découpe au cryostat ultérieur de tranches fixes pour l'analyse nécessitent des soins et de l'effort de ces dosages à travailler.

Pour assurer une approche simple et complémentaires pour les études du développement cortical début, nous avons modifié l'approche d'une tranche existante de ¹³ à faciliter les études du développement cortical précoce. Nous avons développé un whmodèle ole explant hémisphère semblable à un modèle existant E14 hémisphère qui a impliqué cultures secousses à 65 rotations par minute et permet la croissance organotypique pour 16-18 heures ^22,23. Dans notre approche, les explants hémisphère entières sont placées sur membrane semi-perméable ¹³ avec la culture, dans une atmosphère d'oxygène à haute ^21,24 organotypique de prolonger la croissance corticale pendant 48 heures. Cette approche permet également d'électroporation cohérente de développement des neurones corticaux. Les embryons sont retirés de l'utérus et une électroporation pour introduire l'ADN plasmidique et le télencéphale est ensuite découpé. Chaque hémisphère est isolé et placé côté médial vers le bas sur un filtre revêtu de collagène. L'explant est ensuite mis en culture pour une période de 48 heures, une période qui englobe ⁸ fractionnement preplate. Au cours de la période de culture, les neurones L6 développer à partir de précurseur de neurone différencié ^25, correctement positionnée à l'intérieur de la plaque corticale. Tout au long de cette période, le développement deneurone est entouré par l'ECM approprié et des types de cellules qui face la cellule correspondant in vivo. Ce système a déjà avéré utile pour déchiffrer les événements cellulaires qui sous-tendent toxicité de l'éthanol ^26, couche 6 formation et diviser preplate ^7,25.

Protocol

1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide Plasmide solutions d'injection d'ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN 27 dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d'ADN en tant que traceur injection. Pour prépare…

Representative Results

Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d'environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex 28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c'est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 5) et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 5). Fra…

Discussion

Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental – explants hémisphère entiers – pour l'étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s'est révélé utile pour l'analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral ^25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l'accès expérimental aux neurones pour…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments (optional)
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Culture insert collagen coated	Costar	3492
Bovine skin gelatin	Sigma	G9382
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Bovine Serum Albumin	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Tweezer electrodes 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubator	Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton syringe (5 uL)	Hamilton	87930
Hamilton syringe needle	Hamilton	7803-04	Specify 1″ and style 4
Dumont #5 Forceps	FST	11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm	FST	14058-09