Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры
Summary
Этот протокол описывает улучшенную процедуру эксплантов, что включает в себя<em> Экс внутриутробно</em> Электропорации, рассечение и культуры целых полушарий головного мозга из эмбриональных мыши. Подготовка облегчает фармакологических исследований и анализов функции гена в начале развития коры.
Abstract
Кортикальные развития предполагает сложное взаимодействие между нейронами и не-нейрональных элементов, включая клетки-предшественники, кровеносных сосудов, мозговых оболочек и связанных с ними внеклеточного матрикса. Потому что они предоставляют подходящую органотипических окружающей среды, корковой эксплантов срез часто используются, чтобы исследовать те взаимодействия, которые контролируют дифференцировку нейронов и развития. Хотя полезно, модель срез эксплантов могут страдать от недостатка том числе аберрантных сотовой ламинирования и миграции. Здесь мы приводим все системы мозгового полушария эксплантов для изучения раннего развития коры, которое легче подготовить, чем кортикальные ломтиками и показывает последовательное органотипических миграции и ламинирование. В этой модели система раннего ламинирования и миграции проходят нормально в течение двух дней в пробирке, включая период preplate расщеплению, в ходе которой предполагаемый кортикальный слой шесть форм. Затем мы разработали бывшего электропорации внутриутробно (EUEP)Подход, который достигает ~ 80% успеха в планировании GFP выражение для развивающихся нейронов в спинном медиальная кора.
Вся модель эксплантов полушарие делает раннего развития коры доступными для электропорации, фармакологическое вмешательство и живой подходы изображений. Этот метод позволяет избежать выживание операции требуется внутриутробно электропорации (IUEP) подходов при одновременном повышении и трансфекции и площадные таргетинга консистенции. Этот метод будет способствовать экспериментальных исследований нейронов пролиферации, миграции и дифференциации.
Introduction
Млекопитающих мозговой коры форм на основе согласованных пролиферации, миграции и дифференцировки последовательно генерируются нейронов. Каждый нейрон родился в вентрикулярной зоне (VZ) и мигрирует из VZ в промежуточной зоны (ИЗ), образуя кортикальной пластинки (CP) 1. Как они проходят через различные корковых областей, мигрирующие нейроны отображать несколько режимов миграции 2,3, что зависит от внеклеточной среды и других клеточных элементов (например, радиальной глии) в развивающиеся ткани. Корковых нейронов затем арестовать миграции в верхней части формирования кортикальной пластинки в совпадающие процессы нейронов арест миграции и дендритогенез 4.
Кортикальные развития, начатый между эмбриональными дней 11-13 (E11-13) с 5 по созданию первичного слоя плексиформные 6 или preplate (PP), слой пионером нейронов, которые перекрывает VZ. Перспективныйслой 6 корковых нейронов (т.е. первый корковых нейронов родился в VZ), то ориентировать свои somata в стереотипные модели и сливаются в различных слоя в пределах PP 7. Эти события разделили preplate в поверхностном предельные (будущий корковый слой 1) и глубоководной зоны, последняя состоит из плите клетки (переходные коркового слоя 7). Этот процесс, называемый preplate расщепления, является основополагающим событием в будущем рост коры головного мозга 8.
Многие генетические мутации были идентифицированы, которые нарушают различные аспекты развития коры 9. Развития коры также может быть негативное влияние воздействия попадании токсинов, таких как кокаин, алкоголь 10 и 11. Потому что корковые пороки развития, возникающие в процессе развития, скорее всего, вклад в неврологических расстройств (например, аутизм, шизофрения), эмпирические исследования возмущения развития коры присущиют важное. В связи с этим большое значение для создания подходы к изучению развития коры, которые позволяют быстрое анализы генетических или токсин эффекты, но которые также сохранение возможных взаимодействий между дифференциации нейронов, другие типы клеток и внеклеточного матрикса (ECM) в этот ранний период развития мозга 12 .
Slice эксплантов 13 из которых условии, что такая система и была широко используется для анализа развития коры нейрон 14-16. Тем не менее, часть анализов могут страдать от недостатка, что миграцию нейронов и ламинирования может быть ненормальной 17 возможно, связано с повреждением менингеальных клетки, которые окружают развивающегося мозга и якорь радиальной глии эшафот. Как волокон радиальной глии являются важным субстратом для корковых нейронов миграции 18 нарушения базальной пластинки, нарезая может локально нарушить радиальной глии архитектуры и привести к изменению корковых миграции. Кроме того SLIКНИ поверхности эксплантов предоставляет региона мертвых клеток, которые могут изменить нормальный состав ECM в этих областях.
Более поздние подходы были сосредоточены на анализе клеток, расположенных в глубине среза, которые окружены соответствующей здорового типов клеток и ECM. Тем не менее, в некоторых случаях эти новые подходы могут требовать, чтобы оригинал толстый культурный срез быть крио-секционного или парафин-секционного после фиксации, так что относительно нормальный интерьер кусочек становятся доступными для анализа 19-21. Оба оригинальных vibratome секционирования для подготовки живых ломтиками для культуры, а также последующее cryosectioning основных срезы для анализа требуют ухода и усилий для этих анализов, чтобы работать.
Для обеспечения простого, взаимодополняющий подход для исследования ранней развития коры, мы изменили существующие подходы кусочек от 13 до содействия исследованиям раннего развития коры. Мы разработали WHоле полушарии эксплантов модель похожа на существующие модели E14 целом полушарии, участвующих встряхивания культур на 65 оборотов в минуту и позволил органотипических рост в течение 16-18 ч 22,23. В нашем подходе целый эксплантов полушарии расположены на полупроницаемую мембрану 13 с в атмосфере высокой культуры кислорода 21,24 расширить органотипических корковых роста в течение 48 часов. Этот подход также позволяет последовательно электропорации развития корковых нейронов. Эмбрионы удаляют из матки и электропорации введения плазмидной ДНК и конечного мозга, затем расчленены. Каждое полушарие изолирован и помещен медиальной стороне вниз по коллагена покрытием фильтра. Эксплантов затем культивировали в течение 48 часов, период, который охватывает preplate расщепление 8. Во время периода культивирования, L6 нейроны развиваются из предшественников нейронов, чтобы дифференцировать 25, правильно расположены в кортикальной пластинки. В этот период развиваетсянейрон окружен соответствующей ECM и типы клеток, которые противостоят соответствующие клетки в живом организме. Эта система уже доказала ценным в расшифровке клеточных событий, которые лежат в основе этанола токсичность 26, слой 6 формирования и preplate расщепления 7,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы улучшили и оценка экспериментальной модели – все эксплантов полушарие – для изучения раннего развития коры (E13-E15). Модель оказалась полезной для анализа миграции и дифференциации возбуждающих нейронов линии, что составляет слой 6 коры головного мозга 25,37. Принцип преимуществам?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от NINDS (NS066071) и NIAAA. (P50AA017823) в ОЭС. Авторы выражают благодарность д-р Роберт Куинн и персонала в отделе лабораторных животных ресурсов для ухода за животными. Мы благодарим Джадсон Belmont технической поддержки, Николь Belletier для помощи в летние Бакалавриат научный сотрудник (SURF). Мы также благодарим д-р Дэвид Кэмерон комментарии и изменения на более раннюю версию рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
